【摘 要】
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可变剪接（alternative splicing,AS）是真核生物中普遍存在的调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,在昆虫免疫方面也发挥着重要作用。家蚕作为鳞翅目的模式生物,其免疫相关功能研究在蚕丝产业和昆虫生物学研究中都占据了极其重要的地位。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）引发的血液型脓病是养蚕业最严重的蚕病,中肠作为家蚕抵
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可变剪接（alternative splicing,AS）是真核生物中普遍存在的调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,在昆虫免疫方面也发挥着重要作用。家蚕作为鳞翅目的模式生物,其免疫相关功能研究在蚕丝产业和昆虫生物学研究中都占据了极其重要的地位。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）引发的血液型脓病是养蚕业最严重的蚕病,中肠作为家蚕抵抗病原体的第一线防线,病毒入侵势必会影响宿主的基因转录,因此,研究家蚕中肠转录水平的可变剪接与BmNPV之间的关系,有助于进一步补充家蚕对BmNPV抵抗机制的研究。本研究以对BmNPV感性品系P50和抗性品系BC9为研究材料,通过对两品系感染BmNPV与对照的家蚕中肠进行比较转录组学研究,分析与BmNPV感染相关的可变剪接基因,获得了 513个BmNPV侵染相关的候选可变剪接基因,成功筛选到一个可能参与家蚕应答BmNPV的候选可变剪接基因BmCHST4。主要结果如下:1.家蚕中肠应答BmNPV侵染相关AS基因的筛选与功能分析。通过对4组家蚕中肠转录组分析获得了 3449个AS基因,其中与抗性相关AS基因1147个,主要涉及代谢、结合、催化、细胞组分以及刺激应答过程,参与遗传信息处理、代谢等通路;与病毒感染相关的AS基因1082个,主要涉及抗氧化、分子运输、免疫、刺激应答和病毒繁殖,参与免疫系统、病毒性传染病和能量代谢等通路。去除遗传背景和个体免疫应答相关基因后,得到513个可能与家蚕抗BmNPV相关的候选可变剪接差异基因,主要参与病毒的转运、复制、细胞免疫以及凋亡等通路。2.候选可变剪接基因的分析。经特异区段的扩增验证得到8个免疫相关的可变剪接基因:CHST4、Cyclin A、SLC12A6、TLR4、DIA1、Notch 3、ZNF、UPF0669protein C6orf120homolog,其中CHST4在四组中的表达水平与高通量测序结果一致。3.BmCHST4的可变剪接鉴定及生物信息学分析。BmCHST4的可变剪接会产生两种剪接异构体BmCHST-4L和BmCHST-4S,基因ORF长度分别为1233 bp和1074 bp,可变剪接区段为379 bp-538 bp,经预测两种剪接异构体编码的蛋白分子量分别为与47.9 kDa和41.8kDa。BmCHST-4S由于缺少53个氨基酸残基,蛋白三维结构也相应改变。蛋白互作分析揭示BmCHST4与Kon-tiki和Hemolectin存在相互作用的关系。4.BmCHST4可变剪接体的组织表达及响应BmNPV侵染分析。BmCHST-4L和BmCHST-4S广泛的分布在家蚕各个组织中,在血液和马氏管中的表达量最高且差异较大。感性品系P50感染BmNPV后,BmCHST-4L和BmCHST-4S在中肠、血淋巴、马氏管中均下调表达;而抗性近等基因系品系BC9感染BmNPV后,BmCHST-4L和BmCHST-4S虽然在中肠中也都下调表达,但在马氏管中均上调表达,在血淋巴中有上调趋势,却未达显著水平;以抗性亲本A35进一步验证发现感染BmNPV后,BmCHST-4L和BmCHST-4S在马氏管中均上调表达,与BC9一致,而在血淋巴中BmCHST-4S明显上调表达。说明BmCHST4的可变剪接可能参与了家蚕对NPV的应答。综述所述,本研究基于家蚕中肠比较转录组学数据,鉴定了与抗性相关和应答BmNPV侵染的可变剪接基因,并发现了可能促进BmNPV入侵家蚕的基因BmCHST4。这些研究将为全面揭示家蚕应答BmNPV,理解家蚕与BmNPV的相互关系提供了新的线索。
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