论文部分内容阅读
背景
心力衰竭不是一个独立的疾病,而是指各种病因所致心脏病的严重阶段,是大多数心血管疾病发生频次最多的终末共同通路。洋地黄作为广泛使用的治疗心衰的强心药,极易引起心律失常等毒副作用。寻找促使洋地黄增效/减毒的方法对提高洋地黄的疗效和安全性意义重大。
目前认为,心力衰竭的病因以缺血性心肌损害为主,神经内分泌过度激活及心室重塑是加重心肌损伤和促进心衰进程的启动因素。基于对上述心衰新的病理生理学认识,其治疗策略从过去针对临床症状的处理到现在的以拮抗神经内分泌为主,治疗方式则采用针对多靶点的联合用药方式,即倡导洋地黄、ACE1、β-受体阻断剂、利尿剂等药物的联合使用。这种联合用药模式虽然一定程度上延缓了心衰的进展,然而增效/减毒效果并不理想,每年仍然有大量有关洋地黄类药物引起心律失常及死亡病例的报道。心衰死亡率日益上升的总体趋势并未得到改善,且长期使用外源性干预的西药,也容易产生耐受和其它相关的副作用。
多年来有关针灸的临床和基础研究表明,针灸可改善缺血性心脏功能损害、抑制缺血性心律失常,针灸与化疗药物联用亦可减少其毒副作用,提示针灸与洋地黄联用可能起到增效/减毒的作用。针刺有可能通过调节ACE和众多与心肌细胞内钙调节相关的分子、结构或功能,抑制心衰的发展;通过改善心肌细胞SR钙泵功能、提高心肌肌钙蛋白对Ca2+的敏感性,来增强心肌收缩功能,并降低洋地黄非毒性的起效浓度,从而起到对洋地黄的增效/减毒作用。因此,我们认为针刺疗法可能同时拥有目前治疗心衰联合用药方案中使用的ACEI、利尿剂、β-受体阻断剂、醛固酮受体拮抗剂、AngⅡ受体拮抗剂、钙增敏剂等类似的多重功能。针刺与洋地黄类药物同用,应该可以在增加其治疗效应的同时,也增加其安全性(增效即意味着减毒),可能是一种较理想的与洋地黄类药物联用的增效/减毒方法。
目的
在以心肌收缩功能评定和心律失常评分为指标,确定电针对洋地黄类药物毒毛旋花子苷K(StrophanthinK,SK)增效/减毒作用的基础上,采用分子生物学、荧光标记法、可视化动缘探测技术,以新近认识的与心衰发生发展和洋地黄类药物导致心律失常等毒副作用的关键因素为主要观察研究重点,分析探讨哪一或哪些因素在介导电针对SK的增效/减毒中发挥作用。从而为非药物疗法的针刺与传统洋地黄类药物联合治疗心力衰竭,开辟一条有效安全的新治疗途径,并为针药结合在治疗其它疾病中的应用提供科学佐证。
方法
本实验采用静脉输入大剂量心得安溶液显著抑制心肌收缩力所致大鼠急性心力衰竭模型。先经微量注射泵恒速(0.2ml/min)向股静脉泵入0.4%心得安溶液4mg/kg,随后调整微量注射泵流速至0.25mg/kg·min-1持续小剂量泵入直至实验结束,动物出现心肌收缩力降低、左室±dp/dtmax降低、心率减慢,以+dp/dtmax下降超过正常值(control)的40%为急性心衰造模成功的标准。
实验使用清洁级健康雄性Wistar大鼠102只,体质量250±30g,随机分为正常对照(normalcontrol,NC)组,心衰模型(heartfailure,HF)组,心衰+电针内关穴(electroacupuncture,EA)组,心衰+静脉注射(intravenousinjection,Ⅳ)SK小、中、大剂量组,心衰+电针内关+静脉注射(EA-Ⅳ)SK小、中、大剂量组。EA组和EA—Ⅳ各组于造模成功后电针大鼠双侧内关穴30min(电针参数:强度3mA,频率2/15Hz),电针开始的同时立即向股静脉推注5%葡萄糖注射液或SK药液;NC组、HF组造模成功后不电针,直接向股静脉推注5%葡萄糖注射液;Ⅳ各组造模成功后不电针,仅向股静脉推注SK药液。
实验共分两部分进行。
第一部分主要是以左心室血流动力学和心律失常评分为指标,观察电针对SK的增效/减毒作用:将动物腹腔注射麻醉后,气管插管并结扎固定,连接人工呼吸机维持呼吸。记录常规Ⅱ导联心电图,以分析心律失常评分等。暴露右侧颈动脉,经右侧颈动脉逆行插管进入左心室,插管的另一头连接压力传感器以记录左心室血流动力学指标,包括左心室收缩压(leftventricularsystolicpressure,LVSP)、左心室舒张末期压(leftventricularenddiastolicpressure,LVEDP)、心率(heartrate,HR)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等。
第二部分主要是电针对SK治疗心衰的增效/减毒作用的机制探讨:于前部分工作证明电针内关穴对SK增效/减毒作用的基础上,采用分子生物学、细胞内钙检测技术等手段,对与心衰心室重塑及发展预后密切相关的ACE浓度、与心肌收缩性能和心肌损害密切相关的细胞内钙和收缩幅度变化、与洋地黄所致心律失常发生有关的细胞内钙振荡以及与钙调节机制相关的β1-AR、cTnC、SERCA2a、PLB、NCX1蛋白等重要靶点进行系统研究,以期辨明哪一或哪些关键因素参与了介导电针对SK的增效/减毒机制。
结果
1电针对SK增效/减毒作用的疗效确定
首先,本研究进行了SK最佳干预剂量和最佳干预方式的筛选。选用小(0.2914mg/kg,ⅳ)、中(最大有效治疗量,0.4324mg/kg,ⅳ)、大(等毒性剂量,0.5828mg/kg,ⅳ)三个剂量进行研究,分别单纯静脉注射小、中、大剂量SK,以及在静脉注射SK基础上配合电针内关穴刺激,共计6种干预措施。结果发现:小、中剂量SK可使心衰大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著升高,与HF组相比差异显著(P<0.01),且电针+静脉注射SK的干预方式效果更为明显,与单纯静脉注射相比具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。而大剂量SK虽然在药后的最初10min内能够明显增强心衰大鼠的心肌收缩舒张功能,但大多数于药后50min内出现不同程度的房性和室性心律失常,如房早、室早、室速等等,从而使LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明显下降,说明洋地黄中毒表现明显,收缩和舒张功能与HF组动物相比,不仅无明显改善,甚至有所下降。静脉注射大剂量SK的同时配合电针在一定程度有延迟洋地黄致心律失常发生的趋势,但最终并未明显抑制大剂量所致的心律失常。此外,本研究发现静脉注射SK并未明显影响心衰大鼠的HR,电针+静脉注射SK有增加心衰大鼠HR的趋势,但与HF组相比无统计学差异(P>0.05)。
关于洋地黄诱发心律失常的毒副因素的观察,本研究采用心律失常评分作为评价标准,对6种干预方式心律失常评分进行了比较,实验结果表明:SK小剂量组心律失常评分均为0分,表明小剂量SK静脉注射和电针+小剂量SK静脉注射在药后50rain内均没有心律失常发生;SK大剂量组却于药后50min内出现了不同的房性和室性的心律失常,其评分均明显高于SK小剂量组(P<0.01);和Ⅳ大剂量组相比,Ⅳ中剂量组心律失常评分显著下降(P<0.01),同时EA-Ⅳ中剂量组心律失常评分进一步下降,与Ⅳ中剂量组相比有显著性差异(P<0.05),而与SK小剂量组相比均无统计学差异(P>0.05),表明采用静脉注射中剂量SK时配合电针可以显著抑制心律失常的发生。
因此,在后续的实验中我们将电针+静脉注射中剂量SK作为主要的干预措施进行电针对SK增效/减毒作用的疗效确定及机制探讨。
进一步的研究通过对正常对照组(NC),心衰模型组(HF),心衰+电针内关穴组(EA),心衰+静脉注射SK组(Ⅳ),心衰+电针内关+静脉注射SK组(EA-Ⅳ)大鼠血流动力学的比较,发现单纯电针内关穴、单纯静脉注射SK及电针+静脉注射SK的治疗方式均可以显著升高心衰大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax。其中,EA-Ⅳ组在干预后2min时即可以明显升高LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax,至120min时LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax仍保持在较高水平,与HF组相比均有显著性差异(P<0.01),在不同时间点,与EA组和Ⅳ组相比也有一定差异(P<0.05或P<0.01),此结果表明电针+静脉注射SK可以明显增加急性心衰大鼠的心肌收缩力,且相比较单纯电针和单纯静脉注射的方式而言,确实具有起效快,作用时间窗宽大等优势,其治疗心衰的增效作用明显。
2电针对SK治疗心衰的增效/减毒作用的机制探讨
2.1血管紧张素转换酶(ACE)是否参与介导电针对SK治疗心衰增效作用的研究
HF组大鼠血清中ACE含量明显升高(与NC组相比P<0.01),电针内关+静脉注射SK可以使异常升高的血清ACE含量下降(与HF组相比P<0.05),并趋向于正常水平(与NC组相比P>0.05),其降低血清ACE含量的效果优于单纯电针内关穴组和单纯静脉注射SK组,表明调节循环中ACE含量可能是介导电针对SK治疗心衰的增效作用机制之一。
2.2心肌细胞β1-AR是否参与介导电针对SK治疗心衰增效作用的研究
各组大鼠β1-AR蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05),但HF组心肌细胞在β1-AR激动剂DH作用下的钙瞬变波幅和收缩幅度均明显低于NC组(P<0.01);Ⅳ组心肌细胞在DH作用下的钙瞬变波幅明显高于HF组(P<0.01);EA组、EA-Ⅳ组心肌细胞在DH作用下的钙瞬变波幅和收缩幅度均明显高于HF组(P<0.01)。提示调节β1-AR的反应性可能参与了介导单独电针内关、单独静脉注射SK以及电针+静脉注射SK改善心衰心肌细胞功能的作用;然而,由于β1-AR的含量在三组之间并未见明显差异,表明该功能蛋白可能没有参与介导电针对SK的增效/减毒作用。
2.3电针+静脉注射SK对心衰大鼠单个心肌细胞静息钙水平、钙瞬变及收缩功能的影响
HF组大鼠心肌细胞静息[Ca2+]ⅰ和电刺激状态下钙瞬变幅度与NC组相比均显著升高(P<0.01),然而,其细胞收缩功能却是明显降低的(与NC组相比P<0.01),表明心衰大鼠的心肌收缩机构蛋白对细胞内钙的敏感性下降,从而导致心肌细胞收缩性能低下。EA组、Ⅳ组、EA-Ⅳ组均能不同程度地降低心肌细胞静息[Ca2+]ⅰ水平和电刺激状态下钙瞬变幅度,不同程度的增加心肌细胞收缩幅度,结合同步分析单个心肌细胞内钙瞬变及其舒缩过程的对应比例变化发现,EA-Ⅳ组的钙瞬变幅度/细胞收缩幅度(%)明显低于HF组的相应比值(P<0.01),且亦明显低于EA组、Ⅳ组的相应比值(P均<0.05),表明电针+静脉注射SK可以明显改善急性心衰导致的钙减敏效应,增强钙利用效率,提示改善心衰大鼠的心肌收缩机构蛋白对细胞内钙的敏感性可能是电针对SK治疗心衰的增效作用的机制之一。
2.4电针减轻SK所致心律失常毒副作用的机制研究--细胞内钙振荡的观察
HF组静息状态和电场刺激状态下心肌细胞钙振荡次数均明显增加(与NC组相比P<0.01),Ⅳ组、EA-Ⅳ组钙振荡次数均明显低于HF组(P<0.05或P<0.01),EA-Ⅳ组在电场刺激状态下钙振荡次数亦明显低于Ⅳ组(P<0.05),而接近于NC组(P>0.05),提示电针可能通过减少心肌细胞钙振荡的发生从而抑制SK治疗心衰时诱发的心律失常(减毒作用)。
2.5肌浆网SERCA2蛋白及PLB是否参与介导电针对SK治疗心衰增效/减毒作用的研究
HF组大鼠PLB蛋白和磷酸化PLB(p-PLB)蛋白、SERCA2a蛋白的表达均显著升高(与NC组相比P<0.01),考虑此种变化与心衰动物模型的种类和急性心衰初期的代偿性反应有关。EA组、Ⅳ组、EA-Ⅳ组大鼠的PLB蛋白和磷酸化PLB(p-PLB)蛋白、SERCA2a蛋白的表达均比HF组明显降低(P<0.01),并趋向于正常水平,提示可能以上三种蛋白均参与了介导电针内关和/或静脉注射SK改善心肌细胞功能的作用。由于EA组、Ⅳ组、EAⅣ三组之间的PLB蛋白和磷酸化PLB(p-PLB)蛋白、SERCA2a蛋白等参数没有明显的区别,因此,不能肯定上述功能蛋白参与了介导电针对SK的增效/减毒作用。
2.6心肌细胞NCX1是否参与介导电针对SK治疗心衰增效/减毒作用的研究
EA组、Ⅳ组、EA-Ⅳ组大鼠NCX1蛋白表达与HF组、NC组相比均无统计学差异(P均>0.05),可见屯针内关和/或静脉注射SK对急性心衰大鼠NCX1蛋白表达的影响并不明显,因此不能肯定NCX1参与介导了电针对SK的增效/减毒作用。
2.7心肌肌钙蛋白C(cTnC)是否参与介导电针对SK增效作用的研究
HF组大鼠cTnC含量与NC组相比显著升高(P<0.01),经电针内关和/或静脉注射SK干预后,EA组、Ⅳ组、EA-Ⅳ组cTnC含量均明显低于HF组(P<0.01),而与NC组相仿(P>0.05)。提示电针内关穴、单纯静脉注射SK、电针内关+静脉注射SK均能使实验性急性心衰大鼠代偿性增高的cTnC表达下降,然而,由于该功能蛋白的含量在三组之间并未见明显差异,表明电针对SK的增效/减毒作用可能不是通过调节该功能蛋白的含量而实现的。
结论
1静脉输入大剂量心得安溶液所致大鼠急性心力衰竭模型可以明显降低大鼠的左心室内压;减慢心率;减低左心室内压最大收缩/舒张速率等血流动力学指标,且左心室内压最大收缩速率降低超过正常值的40%,符合急性心衰造模成功标准,可用于实验性心衰相关研究。
2电针内关穴+静脉注射SK能明显增加心肌收缩性能,其作用优于单独电针内关穴和单独静脉注射SK;同时,电针还可明显抑制静脉注射中剂量SK引起的心律失常,并可抑制电刺激下单个心肌细胞钙振荡次数:电针对SK具有增效/减毒作用。3心肌cTnC、SERCA2a、PLB、p-PLB等蛋白以及β1-AR的反应性参与介导了单独电针、单独静脉注射SK以及电针+静脉注射SK改善心衰心肌细胞功能的作用;然而,由于上述功能蛋白的含量在三组之间并未见明显差异,表明电针对SK的增效/减毒作用可能不是通过调节上述功能蛋白的含量实现的。
4调节ACE浓度、增加心肌收缩机构对钙的敏感性可能是介导电针对SK增效/减毒作用的内在机制。