论文部分内容阅读
砷及其大量化合物是天然存在的强大毒素,并能够通过污染水、食物和土壤在全球范围内广泛传播。它不仅被用于医药,还用于农业,畜牧业,电子,工业和冶金等各个领域。并且砷是最有效的肝毒性因子,肝脏是代谢的重要器官,也是砷甲基化的主要场所。前期研究表明,砷作用下鸡肝脏细胞有明显的凋亡现象,但具体机制还待考究。相关研究报道称lncRNA能够调控miRNA进而影响靶基因形成竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络从而引起下游通路变化。实验室早先的研究证明了lncRNA2676/miR-221-3p/BUB1三者之间的靶向关系。本研究通过建立鸡的三氧化二砷(As2O3)致肝中毒模型,运用实时荧光定量技术(q-PCR)确定了 lncRNA2676和BUB1在实验模型中的表达上升以及miR-221-3p的表达下降。此外,应用病理学观察和抗氧化水平检测(GSH,GSH-PX,H2O2,NO)确定了 As2O3的肝毒性。应用超微结构观察、q-PCR、western blot等技术检测了 As2O3致肝中毒模型中凋亡的发生和细胞周期的阻滞。在体外应用鸡LMH细胞建立As2O3中毒模型,并建立lncRNA2676的敲低模型以及miR-221-3p和BUB1的敲低及过表达模型,并进行Rescue experiments(拯救实验),研究lncRNA2676/miR-221/3p-BUB1在As2O3致肝细胞毒性中的作用机制。结果表明:1.给鸡饲喂As2O3含量为30 mg/kg的日粮,为期90天,组织病理学观察发现实验组肝脏受损,电镜观察表明肝脏出现严重的凋亡,并伴随氧化应激的发生。荧光定量和免疫印迹实验表明,促凋亡基因的转录和翻译水平明显上调,并且G2/M标志性基因水平显著上升,意味着凋亡和周期阻滞的发生。2.用不同作用浓度的As2O3溶液培养LMH细胞,MTT实验确定其半抑制浓度(IC50)为23.24 μM。同时检测到凋亡水平的上升和G2/M期阻滞,活性氧(ROS)检测意味着氧化应激的发生。表明As2O3致肝凋亡的体外模型的成功建立。3.进行lncRNA2676、miR-221-3p,BUB1的敲低/过表达,并进行拯救实验。结果表明,BUB1能够促进As2O3作用下的G2/M期阻滞和细胞凋亡;miR-221-3p能抑制As2O3诱导的凋亡,并被BUB1的过表达所减弱;lncRNA2676的敲低能够抑制As2O3诱导的凋亡,并被miR-221-3p的敲低所减弱。综上所述,As2O3引起鸡肝组织病理学损伤,并诱导了氧化应激。此外,As2O3还导致了 lncRNA2676的水平升高,进而通过抑制miR-221-3p增加了 BUB1的表达,导致细胞G2/M期阻滞,最终发生凋亡。本研究为ceRNA网络调节As2O3中毒的作用机制奠定了基础,为家禽砷中毒的防治提供了理论依据。