kigamicins是一类由Ⅱ型聚酮合成酶催化合成的聚酮化合物,具有抗菌和特异性抗肿瘤活性。对其生物合成基因簇进行基因测序和ORF功能分析,发现生物合成基因簇中含有一个可能编码天冬酰胺合成酶的基因——orf56。结合kigamicins的化学结构,这个基因可能参与其含氮杂环中氨基的引入。为了证实和研究Off56在kigamicins生物合成中的功能,我们采用基因敲除orf56,随后对比表达产物的化学结构的实验思路。首先,通过生物信息学分析Orf56,推测它属于Ⅱ型谷氨酰胺转移酶,功能类似大肠杆菌天冬酰胺合成酶B。与几种参与聚酮化合物氨基掺入的氨基转移酶具有高度同源性。从而初步推测它参与kigamicins的生物合成。然后,我们运用PCR技术扩增获得一段两端与oef56两端同源的壮观霉素抗性基因匣子。将其转化到含有E.coil BW25113/pIJ 790/pLL 59中构建pLL 137质粒,通过壮观霉素抗性筛选及PCR验证,初步证明oef56基因敲除成功。最后,pLL 137 和 pLL 68(携带调节基因)转化到Steptomyces lividans K4中,在其产物中发现两个化合物,且P[M+H]/+峰m/z=513(组分1)和[M+H]/+峰=497(组分2)。组分1与前期推测的未发生转氨作用前的化合物分子量大小相同,而组分2与组分1可能相差一个氧原子,可能是组分1 C1上的羧基与邻近酮基缩合形成的。通过对发酵产物分离纯化,获得组分1和组分2。利用高分辨质谱,做拟合元素组成,获得两个化合物的分子式,即C26H24O11(组分1)和C26H24O10(组分2)。再进行NMR鉴定,推测其化学结构。证明了组分1的羧基和酮基缩合形成组分2。将组分1于kigamicins的母核比较,确定Orf56是在聚酮碳链环化后参与kigamicins的氨基引入。