论文部分内容阅读
目的通过检测在原发性肝细胞癌组织、与其对应的癌旁组织和正常肝组织中S100A8的表达情况，探讨S100A8与原发性肝细胞癌的关系及其临床意义。方法收集自2011年3月至2013年6月期间在广西医科大学第一附属医院经外科手术切除并经病理证实为肝细胞癌的组织及与其对应的癌旁组织各42例和正常肝组织11例。统计患者的临床相关信息，主要内容包括：性别、年龄、原发肿瘤的大小、血清中乙型肝炎病毒的感染、血清中甲胎蛋白的水平、是否有门脉癌栓、分化程度、肿瘤转移情况及临床病理分期等。本实验使用甲基化芯片技术筛选出肝细胞癌组织及其对应的癌旁组织中有表达差异的基因-S100A8，并选择与其相匹配的基因序列。使用NCBI网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)对基因序列进行比对，根据比对结果，确认靶基因S100A8，并从中筛选出基因序列用来设计甲基化特异性引物。用甲基化引物设计专用软件设计包含目的位点（CpG位点）的S100A8基因的上、下游扩增引物和甲基化测序引物；电泳验证聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增产物的特异性后，使用焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术检测S100A8基因目的位点在肝细胞癌组织及其相应的癌旁组织中的DNA甲基化水平。采用实时荧光定量PCR (Real timequantitative PCR,RT-qPCR)和免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)技术检测S100A8在肝细胞癌组织、与其对应的癌旁组织及正常肝组织中的表达情况。采用统计软件SPSS16.0对实验数据结果进行统计学分析，P<0.05认为差异有统计学意义。结果1.通过甲基化基因芯片数据分析，发现在肝细胞癌组织及与其相应的癌旁组织中S100A8基因部分CpG位点（cg20070090）的DNA甲基化水平存在着差异。2.焦磷酸甲基化测序发现S100A8基因CpG位点（cg20070090）在肝癌组织中甲基化表达水平降低，而在其对应的癌旁组织中甲基化水平显著升高；两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。3.实时荧光定量PCR结果显示：肝细胞癌组织中S100A8mRNA的表达水平比其在癌旁组织、正常肝组织中的表达水平高。4.免疫组织化学结果显示：S100A8蛋白在肝细胞癌组织、癌旁组织及正常肝组织中阳性表达率为分别为52.38%(22/42)、11.90%(5/42)和9.09%(1/11)。S100A8蛋白在肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织及正常肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)，而其在癌旁组织与正常肝组织中的阳性表达率差异无统计学意义。将患者的临床资料与肝细胞癌中S100A8的阳性表达率进行比较，发现其表达阳性率与与肿瘤的分化程度有关，而与患者年龄、性别、HBV感染、AFP水平、肿瘤大小、转移、是否有门脉癌栓及临床分级等均无明显关系。结论1.肝细胞癌组织中S100A8基因CpG位点(cg20070090) DNA甲基化的水平明显低于癌旁组织。2.与癌旁组织及正常肝组织相比，S100A8mRNA在肝细胞癌组织中的表达水平更高。3.S100A8蛋白在肝细胞癌中表达阳性率显著高于癌旁及正常肝组织。4.在分化程度不同的肝细胞癌细胞中，S100A8蛋白表达阳性率也不相同，分化越低，阳性率越高。