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紫草宁及衍生物（后统称紫草宁）是紫草根部的红色提取物,主成分为萘醌类。不仅能用于治疗创伤、烧伤、痔疮等皮肤性疾病,还具有抗炎杀菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。因此,提高紫草宁产量有很大的市场价值和应用前景,而其合成及调控的机制研究是一重大突破口。紫草宁生物合成上游的两条主要途径——甲羟戊酸（Mevalonate,MVA）途径和苯丙素类（Phenylpropanoids,PP）途径目前已基本明确,但合成下游的部分反应尚不清楚,尤其是3-羟基对苯二酚香叶醌向紫草宁转化所涉及到的反应机制。本课题组前期的转录研究中发现一个基因——8-HGO,其在紫草生长培养基B5中表达量低,但在紫草宁合成培养基M9中高表达。大量文献表明,8-HGO编码的8-羟香叶醇脱氢酶（8-hydroxygeraniol dehydrogenase,8-HGO）,在许多次生代谢产物的环烯醚萜合成途径中发挥关键脱氢作用。因此,本实验试图克隆该基因并解析8-HGO在紫草宁合成调控中的功能。基于硬紫草的转录组测序结果,我们获得8-HGO的原始c DNA序列,利用生信软件分析8-HGO的蛋白理化性质,预测其蛋白二三级结构。结果显示:8-HGO的全长ORF为1083bp,可编码360个氨基酸,属于中链锌依赖的醇脱氢酶。我们通过设计引物、克隆目的基因,并以p BI121-e GFP质粒为载体,构建过表达和RNAi载体并导入发根农杆菌ATCC15834中,侵染外植体以诱导得到硬紫草的过表达转基因毛状根（8-HGO-O,HO）、RNAi转基因毛状根（8-HGO-RNAi,Hi）、转p BI121-e GFP质粒的毛状根（Empty vector,EV）三种,每种不少于6个株系。收集并提取M9培养液和毛状根中的紫草宁并测定OD520值以计算紫草宁含量,利用HPLC检测各类毛状根产物成分,此外,检测目的基因和相关调控基因的表达量以进一步探究8-HGO的功能。为了验证毛状根,首先,通过PCR检测到各株毛状根中的rol C、GFP基因,接着用激光共聚焦显微镜观察,发现EV和HO、Hi的转基因毛状根均有荧光,进一步证明已成功得到8-HGO转基因毛状根,为探究8-HGO在紫草重要次生代谢物的合成与调控提供尤为关键且重要的实验材料。HO、Hi和EV毛状根在M9培养液中培养6d,肉眼观察到HO毛状根所在的溶液紫色最深,Hi和EV颜色相近。HPLC图谱表明,M9培养液中毛状根分泌的主产物为紫草宁和乙酰紫草宁。q PCR结果显示,相比于EV,8-HGO表达量在HO高表达,在Hi-8中被抑制,表明HO系列毛状根效果明显,且Hi-8的干扰效果可行。计算并比较毛状根中紫草宁含量,发现8-HGO过表达可提高紫草宁含量,表明其可能参与调控紫草宁的合成。但紫草宁合成相关基因表达的初步结果显示,8-HGO对PGT、PAL和HMGR的基因表达影响较小。综上,从多方面初步探测8-HGO的功能,为紫草次生代谢的调控研究提供了必要的先行实验和理论,但具体机制还需要进行更多的实验来探究。