论文部分内容阅读
脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）作为机体内重要的一种甾体类化合物，是体内各种类固醇激素合成的重要前体。DHEA与其他类固醇激素最大的不同之处在于其血浆中的浓度会随着年龄的增长下降明显，故推测DHEA的减少与机体衰老密切相关。H2O2作为活性氧在体内的主要存在形式，其极易透过细胞膜对细胞造成损伤。睾丸间质细胞是合成和分泌雄激素的主要场所，而睾酮作为雄性动物体内最重要的雄激素，其含量的95％是由睾丸间质细胞分泌的。已有研究表明，外源性DHEA对H2O2引起的细胞损伤具有一定保护和修复作用，但其具体机制还不是很清楚。因此，本试验在建立一种可靠的H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞氧化损伤模型基础之上，探讨外源性DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞抗氧化功能、核DNA损伤以及细胞凋亡相关因子的影响;在证实DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞抗氧化功能及核DNA损伤具有一定的保护和修复作用基础之上，重点从基因和蛋白水平上检测DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞凋亡途径中相关因子mRNA和蛋白表达水平的变化的影响，进而深入探讨PI3K/Akt信号通路在细胞凋亡过程中的作用，研究旨在揭示DHEA在降低H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞凋亡过程中的作用，从而为深入阐明DHEA的抗氧化损伤作用提供理论基础和实验依据。 1、H2O2诱导原代大鼠睾丸间质细胞氧化损伤模型的建立 为了建立体外模拟氧自由基诱导的细胞氧化损伤模型，本试验采用Percoll密度梯度离心法纯化原代大鼠睾丸间质细胞，并鉴定特异性蛋白3β-HSD;采用MTT法检测细胞活力，流式细胞术测定细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS以及O2-含量，比色法测定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性。结果显示:特异性蛋白3β-HSD鉴定后，荧光显微镜观察到大部分细胞呈现特异性荧光。MTT测定结果显示，300～1000μmol/L H2O2处理Leydig细胞均可极显著降低细胞活力(P＜0.01);300μmol/L H2O2处理可显著升高Leydig细胞的凋亡率（P＜0.05）以及增加ROS含量(P＜0.05)和·OH含量(P＜0.01），但可显著降低线粒体膜电位(P＜0.05)。 H2O2处理对细胞内SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性无显著影响(P＞0.05)，但可显著升高细胞内MDA的含量（P＜0.05）。结论:300μmol/LH2O2处理Leydig细胞8h可以诱导细胞氧化损伤，成功建立了体外模拟氧自由基诱导细胞氧化损伤模型。 2、DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞氧化损伤的保护作用研究 本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象，以300μmol/LH2O2为氧化损伤诱导剂，探讨外源性DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞抗氧化功能和细胞凋亡相关因子的影响。用含DHEA终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的培养液孵育原代大鼠睾丸间质细胞24h以含0.1％DMSO作为对照组;;之后各处理组用终浓度为300μmol/L的H2O2培养液诱导原代大鼠睾丸间质细胞8h，收集细胞，待测。采用MTT法检测细胞活力、放射免疫分析法检测睾酮含量，流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS和O2-含量，比色法测定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性，单细胞凝胶电泳技术检测核DNA损伤，Real-time PCR法检测OGG1、Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7mRNA表达水平的变化。结果显示，与损伤对照组相比，DHEA处理可显著提高细胞活力(P＜0.05），并同时可恢复原代大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的生物学功能(P＜0.01); DHEA处理可显著降低细胞ROS含量(P＜0.05)、MDA含量(P＜0.05)和·OH含量(P＜0.01）; DHEA处理可显著提高细胞POD活性(P＜0.05），但显著降低细胞GSH-Px活性(P＜0.05）;不同浓度的DHEA处理对细胞O2-含量、SOD及CAT活性并无显著影响(P＜0.05）。结果提示，DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞活力下降和分泌睾酮功减弱起到一定保护作用;对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞抗氧化功能减弱的保护作用是通过增强POD活性，减少·OH及由其攻击细胞膜产生的MDA含量，最终降低机体内ROS的含量，并增强机体内抗氧化酶的活性来实现的。 与损伤对照组相比，DHEA处理可显著降低细胞凋亡率（P＜0.05）和极显著降低细胞核DNA Olive尾矩（P＜0.01）;DHEA处理可显著提高OGG1 mRNA表达水平(P＜0.05)，同时可显著降低Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7 mRNA表达水平(P＜0.05)。结果提示，DHEA对H2O2诱导原代大鼠睾丸间质细胞核DNA损伤具有一定保护作用，主要是通过增强OGG1 mRNA水平表达来实现;DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞凋亡的保护作用主要是降低凋亡基因Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7 mRNA表达水平以及Bax/Bcl-2比值，最终减少细胞凋亡。 3、DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞氧化损伤的修复作用及其机制研究 本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象，以300μmol/L H2O2为氧化损伤诱导剂，探讨外源性DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞抗氧化功能、细胞凋亡的影响及其细胞生物学机制的研究。用含H2O2终浓度为300μmol/L的培养液诱导原代大鼠睾丸间质细胞8h，造成睾丸间质细胞氧化损伤后，再用含DHEA终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的培养液孵育原代大鼠睾丸间质细胞24h，以含0.1％DMSO作为对照组，收集细胞，待测。采用MTT法检测细胞活力、放射免疫分析法检测睾酮含量，流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS和O2-含量，比色法测定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶活性，单细胞凝胶电泳技术检测核DNA损伤，Real-time PCR法检测DNA损伤的修复基因以及细胞凋亡基因mRNA表达水平的变化，western blot检测细胞凋亡途径中关键因子的表达变化。结果表明，与损伤对照组相比，DHEA处理可极显著提高细胞活力(P＜0.01)，并可恢复原代睾丸间质细胞分泌睾酮的生物学功能(P＜0.01); DHEA处理可极显著降低细胞ROS和·OH的含量(P＜0.01); DHEA处理可显著提高睾丸间质细胞内SOD、CAT和POD活性（P＜0.05），同时DHEA处理可显著降低细胞MDA含量(P＜0.05）。结果提示，DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞活力下降和睾酮分泌功能的降低起到一定修复作用;对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞抗氧化功能减弱的修复作用是通过增强SOD、CAT及POD活性，减少·OH及由其攻击细胞膜产生的MDA含量，最终降低细胞内ROS含量并增强机体内抗氧化酶活性实现的。 与损伤对照组相比，DHEA处理可显著降低细胞凋亡率(P＜0.05)和极显著降低细胞核DNA Olive尾矩(P＜0.01); DHEA处理可显著提高细胞线粒体膜电位(P＜0.05）;不同浓度的DHEA处理可显著提高细胞OGG1、PI3K、Akt和Bcl-2 mRNA表达水平(P＜0.05），同时可显著降低细胞Bax、caspase-9、caspase-3和caspase-7 mRNA表达水平(P＜0.05)。 Western blot分析结果表明，DHEA处理可显著提高睾丸间质细胞PI3K和p-Akt蛋白表达水平(P＜0.05），且可显著降低细胞Bax和caspase-3蛋白表达水平（P＜0.05）;在加入PI3K抑制剂(LY294002)处理后，DHEA处理可显著降低细胞PI3K(P＜0.05），但对p-Akt、Bax和caspase-3蛋白表达水平并未发现显著影响。结果提示，DHEA对H2O2诱导原代大鼠睾丸间质细胞DNA损伤的修复作用是通过增强OGG1mRNA水平表达来实现;DHEA对H2O2诱导的原代大鼠睾丸间质细胞凋亡的修复作用主要是增强PI3K和p-Akt蛋白表达，降低下游的Bax、caspase-3蛋白表达，最终导致细胞凋亡率的降低。