背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性、不可逆转的神经退行性疾病,迄今病因尚不明确。AD早期临床表现为嗅觉功能障碍,随病情发展,中枢神经系统才出现一系列病理性改变。随着全球人口老龄化问题的日益增加,AD的发病率呈逐年上升的趋势。这必将给社会带来巨大压力并严重影响人类的生活质量,AD已成为当今亟待解决的疑难病症之一。目前临床上针对淀粉样沉积研发的药物对AD的治疗只是短暂有效,并不能延缓疾病的进程。大量研究发现,过磷酸化Tau蛋白(P-tau)存在于许多神经退行性疾病的脑组织中,同时Tau病变疾病中,在缺乏淀粉样蛋白病理的情况下一系列的神经变性仍然发生。因此可看出,过磷酸化Tau蛋白在AD的病程中起到关键作用。近四十年的研究中,过磷酸化Tau蛋白在AD的学习记忆障碍中的作用机制已取得较多进展,但在Tau的过度磷酸化对AD嗅球相关的研究少之又少。因此,本文的重点主要放在阿尔茨海默病模型鼠中Tau蛋白过度磷酸化对嗅球系统功能变化研究。嗅觉系统是感觉神经系统的一个重要组成部分,而在嗅觉系统中,嗅球是嗅觉信息向中枢传递的第二站,在嗅觉的信号传递、嗅觉信息的编码中发挥着极其重要的作用。然而在基因突变Tau过表达的P301S模型鼠中,过磷酸化Tau蛋白主要通过影响哪类神经元从而诱发早期嗅觉功能障碍?以及过磷酸化Tau蛋白如何参与嗅觉的信号传递、嗅觉信息的编码呢?解答以上问题对于深入阐明过磷酸化Tau在早期嗅觉功能障碍方面的机制至关重要。本课题将对此进行深入探讨。目的1.观察AD患者组和正常衰老组嗅球内过磷酸化Tau表达和分布情况。2.观察P301S转基因小鼠的嗅觉和认知功能行为学变化的时间。3.观察过磷酸化Tau蛋白在嗅球内的表达和分布特点。4.观察过磷酸化Tau对嗅球僧帽细胞形态和功能的变化。5.观察过磷酸化Tau对嗅球外丛状层中树树突触形态及功能的变化。方法1.利用石蜡免疫组化方法观察AD患者组和正常衰老组嗅球内磷酸化Tau表达和分布情况。2.利用食物掩埋实验、Y迷宫和避暗穿梭箱实验明确P301S转基因小鼠出现嗅觉和认知功能行为学变化的时间。3.应用Western blot方法检测小鼠嗅球Tau-5和P-Tau的蛋白表达量。4.采用免疫荧光染色技术观察磷酸化Tau在嗅球中的表达和分布情况。5.应用尼氏染色的方法观察P301S转基因小鼠嗅球内僧帽细胞数目和形态变化。6.利用离体脑片的微电极阵列(MEA)记录系统,记录P301S转基因小鼠嗅球中僧帽细胞层放电频率的变化。7.应用Western blot方法检测P301S转基因小鼠嗅球内突触囊泡相关蛋白的表达量变化。8.应用高尔基染色技术,观察P301S转基因小鼠嗅球颗粒细胞树突棘变化。9.采用透射电镜观察P301S小鼠嗅球中颗粒细胞和僧帽细胞之间的树树突触结构的变化。10.利用离体脑片的微电极阵列(MEA)记录系统,记录P301S转基因小鼠嗅球中外丛状层中Gamma振荡变化。结果1.与正常组相比,AD患者嗅球内磷酸化Tau表达量明显增加,且主要表现为外丛状层和颗粒细胞层内的神经纤维网线和僧帽细胞的胞内神经纤维缠结。2.P301S小鼠从2月龄开始出现嗅觉功能障碍,但从5月龄时才开始出现认知记忆障碍。3.P301S转基因小鼠嗅球内Tau-5和磷酸化Tau的蛋白表达水平明显升高。4.P301S小鼠嗅球内各个层状结构内均有磷酸化tau表达,但2月龄时僧帽细胞是受过磷酸化tau蛋白影响最大的神经元。5.P301S小鼠嗅球的背侧和腹侧的僧帽细胞5月龄时出现数目明显减少的现象。6.P301S小鼠2月龄时嗅球僧帽细胞内过表达的P-tau时其自身的放电频率降低,且随年龄的增加愈加严重。7.P301S小鼠嗅球中的突触前囊泡蛋白表达量从5月龄开始显著降低。8.P301S小鼠嗅球5月龄时,外丛状层中树树突触的兴奋性突触结构和抑制性突触结构均发生改变。9.过磷酸化Tau可引起嗅球内外丛状层Gamma振荡异常增强。结论1.AD患者嗅球内各个层次结构内均有磷酸化Tau表达,且主要聚集备外丛状层和僧帽细胞层。2.P301S转基因小鼠嗅觉功能障碍出现的时间要早于认知功能障碍出现的时间,与AD病人的症状出现的次序相符。3.P301S转基因小鼠出现嗅觉障碍的时间轴与僧帽细胞数目和功能变化的时间轴一致,提示AD出现嗅觉功能障碍可能与的僧帽过表达过磷酸化tau蛋白有关。4.P301S转基因小鼠嗅球中过磷酸化tau可影响树树突触结构,且引起嗅球内EPL层Gamma振荡异常增强。5.2月龄的P301S转基因小鼠嗅球中MCs的放电频率降低并不是由其自身数目减少和GCs对其抑制引起的。