以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN siRNA体内抑制神经母细胞瘤MYCN基因表达的研究

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背景:神经母细胞瘤是儿童外周神经系统最常见的恶性肿瘤。大量研究表明MYCN在决定NB预后的因素中占据重要地位,MYCN基因超量表达时,预后不良;低表达时预后较好,MYCN基因可以作为神经母细胞瘤基因治疗的靶点。建立动物模型,探索体内基因治疗的疗效及其它相关问题具有重要意义。目的:建立神经母细胞瘤皮下移植瘤动物模型,探索以叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN siRNA体内对瘤组织MYCN基因表达水平的影响。方法:选择SCID小鼠10只,将培养的神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液0.5ml(1×10~7/ml)注射于右前腋部皮下,建立神经母细胞瘤皮下移植瘤动物模型。另选择SCID小鼠28只制备神经母细胞瘤皮下移植瘤动物模型,按每组14只随机将动物分为2组,空白对照组、叶酸包裹脂质体MYCN siRNA组(实验组)。当肿瘤组织直径在0.5cm左右时,空白对照组和实验组分别随机采用脱臼法处死4只SCID鼠,测量治疗前MYCN mRNA表达水平。剩余SCID鼠,实验组局部瘤组织中注射叶酸包裹脂质体MYCN siRNA,剂量为3.5mg/kg,每天一次,连续三天,空白对照组相同部位、相同时间注射等量生理盐水,末次注射3小时后脱臼法处死动物,取肿瘤组织,提取总RNA。采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREENⅠ)实时定量RT-PCR体系测定肿瘤组织中的MYCN、GAPDH基因mRNA拷贝数,MYCN mRNA表达水平用MYCN copies/GAPDH copies表示。结果:1.所有动物在注射后5-6天可在右前腋皮下触及小包块,8天肿瘤组织的平均体积为4.6±2.9mm~3,移植瘤动物模型制作成功,成瘤率100%。光镜下检查肿瘤细胞聚集成团,伴有癌结节形成,癌细胞形状不规则,分化差异明显,胞质少,核大,深染,不规则,核仁明显,可见菊团状生长,分化低,NSE(+);2.实验前,空白对照纽和实验组动物瘤组织MYCN mRNA分别为17.8±2.3和17.5±0.9,实验结束后空白对照组和实验组动物瘤组织MYCNmRNA表达水平为18.1±4.6和8.8a±3.5,经t检验,实验前两组间t值=0.3,p=0.7967,p>0.05,实验后两组间t值=4.8,p=0.001,p<0.05。结论:1.在SCID小鼠右前腋皮下接种神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液0.5ml(1×10~7/ml)可成功复制神经母细胞瘤移植瘤动物模型;(2)以叶酸受体为靶向的脂质体MYCN siRNA体内可明显抑制瘤组织MYCN mRNA水平的表达。
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