论文部分内容阅读
糖尿病（（Diabetic Mellitus,DM）是一种非常复杂的代谢性疾病,是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的慢性高血糖。糖尿病被认为是影响创面愈合过程的主要病因之一,创面愈合障碍是糖尿病患者发病和死亡的常见病症。近年来糖尿病在世界范围内发病率上升,糖尿病创面的发病率随之增加,因而发病率、死亡率和医疗费用也随之增加。糖尿病创面是糖尿病的主要并发症,尽管存在诸多风险,目前临床上糖尿病创面的治疗策略仍然有限。中草药治疗慢性疾病如DM有悠久的历史,在临床上发挥巨大的治疗潜力。本研究以黄连（Coptis chinensis）、大青叶（Folium Isatidis）、板蓝根（Radix Isatidis）等为主要组份,经科学配方,提取浓缩制成膏剂,试验其在正常大鼠和Ⅱ型DM模型大鼠外伤的愈合效果及作用机理。目的:试验自制中药配方CMF（Chinese medicine formulation）软膏对正常模型大鼠和Ⅱ型糖尿病模型大鼠创面愈合的影响及作用机理。方法:1.复方主要由黄连、大青叶、板蓝根等多种中草药科学配比组成。将干燥的材料粉碎成粗粉,用蒸馏水提取,减压和冷冻干燥,得到提取物,将提取物与凡士林（1:10）混合制成中药复方CMF软膏,用于实验研究。2.动物分组及创面:（1）正常模型大鼠实验,将72只SD大鼠分为3组（n=24）:正常对照组（NC）、正常阳性药治疗组（碘,NPC）、正常CMF治疗组（NCMF）。（2）Ⅱ型糖尿病（T2DM）模型实验,将96只SD大鼠分为4组（n=24）:糖尿病对照组（DC）、糖尿病阴性对照组（DPJ）、糖尿病阳性对照组（碘,DPC）、糖尿病CMF治疗组（DCMF）。所有动物在给药前一天在无菌条件下,在其背部表面制作创面（3×3 cm）。3.T2DM大鼠模型的建立:大鼠以高脂饲料喂养5周后,腹腔注射链脲佐菌素（STZ 30 mg/kg）,空腹（12小时）血糖值≥13.6 mmol/L的大鼠为造模成功的T2DM模型动物。4.第0、3、7、14和21天分别测体重,记录伤口面积,测T2DM大鼠空腹血糖值,取皮肤伤口组织、血清。1）用ELISA试剂盒测定血清C肽、胰岛素、IL-6、NF-κB浓度。2)H＆E染色检测创面组织的组织学变化,免疫组化分析CD31、PCNA和e NOS的表达。3)RT-qPCR检测创面组织中VEGF、EGF、TGF-β1、SDF-1α、IL-10、IL-1B、TNF-α、NF-κB、MMP-9 m RNA表达。4)Western blotting检测VEGF、TGF-β1、PDGF、EGF、MMP-9、Collagen IV蛋白水平。结果:1.在正常大鼠创伤模型实验中:1)与NC组和NPC组相比,NCMF治疗组在第3、7、14和21天的创面面积显著减少（p＜0.05）,并且创面收缩显著增加（p＜0.05）。2)NCMF组与NC组和NPC组相比,组织学改变明显改善,NCMF组新生血管形成、胶原沉积和成纤维细胞表达均高于NC组和NPC组。NCMF组CD31、PCNA和e NOS水平明显高于NC组和NPC组（p＜0.05）。3)与NC和NPC相比,NCMF在创伤后第7、14和21天通过显著降低NF-κB、TNF-α、IL-1B和MMP-9的表达而减轻炎症。4)与NC和NPC组相比,NCMF在第3、7和14天通过显著增加VEGF、TGF-β1、EGF、PDGF和SDF-1α的水平诱导血管生成和新生血管形成（p＜0.05）,在第21天没有显著差异。2.在糖尿病模型实验中:1)T2DM模型成功以后,体重和血糖在第3、7、14天没有明显差别,在第21天,DCMF组与DC、DPJ、DPC组相比,明显减少。胰岛素和C肽在第14天、21天,DCMF组与DC组相比统计学上有显著性差异（p＜0.05）。与DC、DPJ、DPC组相比,DCMF组的NF-κB、IL-6血清水平在第7、14、21天显著性降低,与DC、DPJ和DPC组相比,DMCF组大鼠在第3、7、14和21天的伤口面积显著减少（p＜0.05）,伤口收缩显著增加（p＜0.05）。2)与DC、DPJ和DPC组相比,DCMF组伤口组织的组织学改变有所改善。DCMF组新生血管形成、胶原沉积和成纤维细胞表达均高于DC、DPJ和DPC组。另外,与DC、DPJ和DPC组相比,DCMF显著上调CD31、PCNA和e NOS的表达（p＜0.05）。3)与DC、DPJ和DPC组相比,DCMF在伤后第7、14和21天通过显著降低NF-κB、TNF-α、IL-1B和MMP-9的表达而减轻炎症。4)与DC、DPJ和DPC组相比,第3、7和14天,DCMF通过显著增加VEGF、TGF-β1、EGF、PDGF和SDF-1α的水平（p＜0.05）诱导血管生成和新生血管形成。结论:本研究提示CMF治疗普通外伤和T2DM创面有良好的药理活性。创面愈合的改善与CMF治疗后炎症减少、血管生成增加和胶原沉积有关。因此,此外用中药复方制剂可为正常外伤创面和糖尿病创面的治疗提供有效途径。