谷胱甘肽（GSH）是一种巯基化合物，是体内重要的抗氧化，抗炎物质。通过谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）的催化作用清除体内多余的氧自由基。Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是合成GSH的限速酶，其催化亚基GCLC具有全酶活性，所以致力于对GCLC基因表达调控的研究对于了解体内GSH水平变化机制有重要意义。有报道指出β-萘黄酮（β-NF）作用人类HeG-2细胞后，可以上调GCLC基因表达水平。其机理在通过改变转录因子的氧化还原状态，使得抗氧化元件（ARE）与转录因子Nrf2结合，促进GCLC基因表达，从而促进γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)水平来促进体内GSH的生物合成。我们在研究中，为了解能够刺激大鼠GCLC基因表达的作用途径，选用多种可能的刺激因子进行筛选，发现β-NF作用于大鼠细胞具有独特的特点，而在大鼠GCLC基因5’上游调控序列启动子区域内缺少ARE元件。基于这样的情况，我们对这一现象进行了初步分析，以探讨大鼠GCLC基因表达调控的特征。　　 目的：　　 在于研究外界刺激因子β-NF在作用浓度范围内对GCLC基因在大鼠RTE细胞和H4ⅡE细胞中差异性表达的影响，从而了解β-NF调控γ-GCS基因转录调节机制。　　 方法：　　 1、刺激因子的筛选：将GCLC基因上游调控序列驱动的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase报道载体与PRL-sv40海肾荧光素酶内参表达质粒分别共转染大鼠支气管上皮细胞(RTE)、大鼠肝癌细胞（H4ⅡE）细胞。待转染12h后，将Bap，TNF-α，GSH，GSSG，Cysteamine，Cystamine，β-NF，α-NF按照所需浓度梯度刺激细胞12h，同时设定DMSO空白对照组。将每种刺激因子在不同浓度作用下的标准化荧光素酶活性值与标准化空白对照组荧光素酶活性值做比较，筛选出对上述两细胞都发挥调控效应的刺激因子及作用浓度。　　 2、荧光定量PCR检测：分别比较RTE细胞和H4ⅡE细胞中，β-NF实验组相对于DMSO空白对照组γ-GCS的mRNA变化倍数。　　 3、确定刺激因子作用区间：转染大鼠GCLC基因5’上游调控序列启动子区域内r系列缺失载体，12h后添加刺激因子，同时设定空白对照组。检测荧光素酶活性值同上。　　 4、作用区间内报道载体的构建及转染：点突变NF-κB/AP-1核心元件报道载体的构建是以GCLC-luc (-1758～+2) 为模板，按照引物导入核心序列突变的方法，通过两次PCR扩增出突变-380～-375和-357～-352的NF-κB/AP-1元件的片段。2种PCR产物胶回收后连入pGEM-T easy载体，以Sac I/Xho I双酶切插入PGL3-enhancer载体鉴定并测序。转染步骤同3。　　 5、刺激因子作用下激酶信号转导通路的筛选：两种细胞培养传代，分别接种于48孔细胞培养板中，12h后添加激酶抑制剂（SB-202358、kenpaullone、k-252a），设定空白对照组。转染步骤同3。　　 6、免疫蛋白印迹(Western Blot)方法检测刺激因子作用下细胞内γ-GCS蛋白、GSK-3β蛋白表达水平。　　 结果：　　 1、转染GCLC-luc到大鼠支气管上皮细胞(RTE)和大鼠肝癌细胞（H4ⅡE），12h后添加不同浓度梯度的各刺激因子。在两种细胞中，β-NF（1～100uM）对GCLC基因表达均具有调控作用，而其他刺激因子在各个浓度梯度范围内没有影响GCLC基因的表达。在大鼠支气管上皮细胞(RTE)，β-NF（1 uM，10 uM，100uM）刺激后GCLC-luc在细胞内萤光素酶活性水平较DMSO空白对照组分别下降了1.61、9.43、16.44倍（P＜0.01）。在大鼠肝癌细胞（H4ⅡE），β-NF（1 uM，10 uM，100uM）刺激后GCLC-luc在细胞内萤光素酶活性水平较DMSO空白对照组上升了1.55、3.73、3.83倍（P＜0.05）。Β-NF（1～100uM）对RTE细胞GCLC基因表达有剂量依赖性抑制作用，对H4ⅡE细胞GCLC基因表达有剂量依赖性上调作用。　　 2、β-NF刺激改变细胞内源性γ-GCS的mRNA水平，在大鼠支气管上皮细胞(RTE)中，实验组γ-GCS的mRNA表达量是空白对照组的2-0.4 倍（P＜0.05）。在大鼠肝癌细胞（H4ⅡE）中，实验组γ-GCS的mRNA表达量是空白对照组的21.03 倍（P＜0.05）。Β-NF（10uM）在转录水平影响两种细胞内源性γ-GCS基因的表达。在RTE细胞中的抑制，以及在H4ⅡE细胞中的促进表达作用。　　 3、将GCLC基因5’上游调控序列启动子区域内r系列缺失载体分别转染两种细胞，在大鼠支气管上皮细胞(RTE)中，转染GCLCL-luc、5r、2r、8r、11r、12r、15a载体，处理组荧光素值较空白对照组荧光素均依次下降了7.84、15.82、12.74、11.02、16.44、10.33、12.22倍（P＜0.01），大鼠肝癌细胞（H4ⅡE）中均依次上升了1.82、1.58、1.86、1.59、2.53、2.82、2.41倍（P＜0.05）。（-1780bp～-390bp）区间内，两种细胞处理组荧光素值与空白对照组荧光素均差异显著。说明β-NF在这一区间并没有作用位点，从β-NF依旧影响GCLC基因的表达，可能作用位点在15a之后的区间即（-390bp～+2bp）。　　 4、将构建成功的GCLC-mut AP-1（-357～-352）–luc、GCLC-mutNF-κB（-380～-375）-luc 以及GCLC-Luc报道载体转染RTE细胞和H4ⅡE细胞，设定β-NF处理组和DMSO空白对照组。在RTE细胞中，转染GCLC-Luc的β-NF处理组较空白对照组下调11.7倍，而GCLC-mut AP-1 –luc、GCLC-mutNF-κB-luc转染后分别下降了15.7倍和12.7倍，下降幅度没有减少，说明此两个元件与β-NF的作用无关。在H4ⅡE细胞中，转染GCLC-Luc的β-NF处理组荧光素酶值较空白对照组上调3.98倍，转染后GCLC-mut AP-1 –luc上升了2.36倍，上升幅度小于野生型（P＜0.05）。转染后GCLC-mutNF-κB-luc上升了4.67倍，上升幅度没有减少，可见，在H4ⅡE细胞中突变AP-1后β-NF上调GCLC基因表达能力低于对野生型的调控,β-NF影响GCLC基因的表达与AP-1作用元件有一定关系。　　 5、在RTE细胞中，kenpaullone（2～20uM）能明显改变β-NF(10uM)对GCLC基因表达的抑制作用，kenpaullone（2、10、20uM）+β-NF(10uM)较β-NF(10uM)的细胞内荧光素酶活性有明显的改变，分别上升了5.28、6.34、6.14倍（P＜0.01），而其他两种激酶抑制剂则没有发挥作用，在H4ⅡE细胞中这三种抑制剂都没有发挥可见效应。已知Kenpaullone是GSK-3β磷酸化位点抑制剂，可见在RTE细胞中，β-NF对GCLC基因表达的抑制作用是通过GSK-3β激酶信号转导通路实现的。　　 6、β-NF刺激后，γ-GCS蛋白存在细胞内差异性表达；GSK-3β在正常情况下以非磷酸化存在，β-NF激活了GSK-3β的9位点的磷酸化，Kenpaullone结合GSK-3β9位点抑制其磷酸化。　　 结论：　　 在大鼠RTE细胞，β-NF激活GSK-3β的9位点磷酸化从而抑制GCLC基因表达，在大鼠H4ⅡE细胞，β-NF部分通过激活AP-1元件上调GCLC基因表达。