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纤维素酶是一类能够降解纤维素,使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称。通过将纤维素物质水解成单糖来发酵产乙醇,可以解决存在于农业、再生能源以及环境污染中的多种问题。同时,纤维素酶的应用已扩展到医药、日用化工、造纸、食品发酵、废水处理、工业洗涤、中草药提取等各个领域。纤维素酶在我国具有广阔的市场,但是,目前高成本、低酶活性已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈,因此提高纤维素酶的活性或表达量,对工、农业生产具有重要的意义。本研究以课题组已构建好的酵母基因工程菌GS115-End和pPIC-Ends为出发菌株,根据pPIC9K的α-factor序列,按照毕赤酵母对密码子的使用偏好,人工设计合成了毕赤酵母表达载体pPIC9K的新型α-factor序列HS。将此HS序列替换质粒pPIC9K-End/Ends中原有的α-factor序列,用此构建好的重组质粒pPIC9K-HS-End和pPIC9K-HS-Ends转化大肠杆菌DH5α。通过PCR和测序鉴定,成功筛选得到了重组DH5α(pPIC9K-HS-End/Ends)菌株。然后提取质粒pPIC9K-HS-End/Ends,经SalI先线性化质粒后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。经MD、MM平板筛选和PCR鉴定,获得了α-factor密码子改造后的内切葡聚糖酶毕赤酵母基因工程菌株,并分别命名为9KHSEGS和9KHSEG。分别对酵母基因工程菌株9KHSEG和9KHSEGS进行纤维素酶活性测定,结果表明26℃下,在BMGY/BMMY培养基中诱导84h时酶活力可以达到最高值,分别为726.8UmL和865.5U/mL,这与出发菌株酶活性水平基本一致。但随着诱导温度的升高或者降低,酶活性也随之降低。在30℃下诱导培养84h时酶活性达最高值,分别为621.71U/mL和676.4U/mL。这与出发菌株相比较,酶活性下降到到原来的79.57%和74.04%。同时,蛋白质含量与原始菌株比较也分别下降14.10%和20.10%。而两者比活力变化并不明显,分别为原始的92.65%和92.68%。实验证明,实施密码子改造后的酵母基因工程菌株9KHSEGS和9KHSEG最适诱导温度为26℃,最佳诱导时间为84h。本实验也证实,α因子密码子改造后影响了内切葡聚糖酶的分泌表达,α因子非尤势密码子对蛋白质的表达分泌有重要的作用。对产内切葡聚糖酶毕赤酵母基因工程菌9KHSEGS和9KHSEG诱导表达产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,表达的酶蛋白分子大小为79.82KD,与原始菌株结果致。最后,对此新构建的两株酵母工程菌株连续传10代培养实验验证证实,内切葡聚糖酶毕赤酵母基因工程菌遗传稳定。