研究背景：诺如病毒(Norovirus, Nov)与札幌样病毒(Sapporolike Virus, SLV)合称为人类杯状病毒(Calicivirus)。该病毒是于1972年,由Kapikian在1968年美国Norwalk地区暴发的急性胃肠炎患者的粪便中采用免疫电镜法检测出来的球状病毒颗粒,直径在27-32nm之间。如今,Nov已成为非细菌性急性胃肠炎的主要病原体。可在幼儿园、夏令营、学校、医院、养老院、餐馆、部队(航海舰队)与游船等小型单位引起暴发,所有年龄段均可被感染。对新世纪多次暴发的腹泻病原分析发现,G Ⅱ型Nov已成为全球病毒性胃肠炎最常见的Nov病毒株,其中GⅡ.4型Nov毒株占主导地位。目前主要采用RT-PCR法检测食物、粪便和水中的Nov,此法敏感性较高、重复性好,但耗时较长,仪器设备要求较高。且由于毒株的多样性,RT-PCR必须要使用混合引物。如今,RT-PCR已逐渐被荧光定量PCR取代,后者更加快速和灵敏,特别是使用Taqman探针时,单次试验即可提供证据并进行定量检测,但此法仪器设备要求高,很难在现场和基层普及。禽类血液中的抗体IgG可转移到卵黄液中,并在胚胎发育过程中对潜在的各种病原体感染起到被动保护作用,这种抗体称为卵黄抗体即IgY。IgY是存在于禽蛋卵黄中的主要抗体,属多克隆抗体,在疾病诊断和防治的应用方面有许多优点。通过免疫血清的途径一次性制备大量抗体是相当困难的,且多次制备会导致抗体的均一性差。产蛋鸡经免疫后,可从其卵黄不断获得特异性抗体。IgY具有特异性强、纯度高等优点,不会与哺乳动物产生过敏反应或交叉血清反应,可替代通过免疫兔、小鼠等哺乳动物而进行抗体的大量生产。近年来,IgY的研究和应用已经成为免疫学领域的热点。Woolley等用重组人白细胞介素-6分别对羊和鸡进行免疫,制备了IgG和IgY,发现两者对人白细胞介素-6都有很高的亲和力,表明IgY可以代替哺乳动物的IgG进行免疫检测。2003年,de-Almeida CM制备了抗BfpA IgY应用于免疫吸附,发现其可以特异性地鉴定EPEC。Ohnishi T等用IgY与IgG进行ELISA检测HGF,发现IgY使灵敏度提高了10倍,不但能检测出血中的HGF,还能检测正常人尿中的HGF。Juliarena等表达了GST-p24融合蛋白,再以此免疫蛋鸡制备了特异性IgY用于免疫诊断。结果表明用IgY检测可避免常规的哺乳动物二抗所带来的交叉反应。IgY作为检测试剂用于一系列的分析技术,将有望更多的应用于诊断试剂的领域,在诊断试剂的开发中发挥重要作用。本研究用GⅡ.4型387型菌株Nov P颗粒蛋白抗原作为抗原免疫产蛋来航鸡制备抗Nov卵黄抗体IgY,在此基础上对IgY进行HRP酶标制备酶标抗体,建立用于检测Nov的双抗体夹心ELISA体系,并进行评价。为IgY今后在诊断和疾病防治方面的应用奠定一定基础,并为Nov的检测和防治提供新的思路。研究目的和内容1.制备特异性抗Nov卵黄抗体IgY。2.研究特异性抗Nov卵黄抗体IgY的特性。3.利用特异性抗Nov卵黄抗体IgY建立双抗体夹心ELISA体系用于Nov的检测,并对其进行初步应用评价。方法：1.抗Nov鸡卵黄抗体IgY的制备(1)采用GⅡ.4型387型菌株Nov P颗粒蛋白抗原与等量弗氏佐剂乳化制备免疫制剂,采用多次多点双翅下肌肉注射的方式免疫产蛋来航鸡；(2)收集免疫前一周及免疫后三个月内的鸡蛋；(3)改良水稀释法和硫酸铵两次分级沉淀法(终饱和度分别为55%和33%)分离、纯化鸡卵黄抗体；(4)间接ELISA法检测鸡IgY各周期的效价变化；(5) SDS-PAGE电泳鉴定鸡IgY的纯度,Western blot法鉴定鸡IgY的特异性；(6)考马斯亮蓝法测定鸡卵黄抗体中的总蛋白含量；(7)将卵黄抗体溶液稀释成不同浓度置于25℃室温环境下评价其室温稳定性；在不同pH环境下作用评价其pH稳定性；在不同温度下处理评价其热稳定性；将其用不同pH环境的胃蛋白酶进行处理,评价胃蛋白酶对鸡卵黄抗体的影响；在-20℃与4℃环境下反复冻融5次,评价反复冻融对其的影响。2.基于抗Nov鸡卵黄抗体的ELISA检测体系的建立及评价(1)采用过碘酸钠法对抗Nov鸡卵黄抗体IgY进行酶标制备酶标抗体;(2)采用280nm下的紫外吸收法测定酶标抗体的蛋白含量,并计算其标记率、克分子比值；(3)利用上述获得的酶标抗体建立双抗体夹心ELISA检测体系；(4)对所建立的双抗体夹心ELISA检测体系的各个条件进行优化；(5)评价所建立的双抗体夹心ELISA体系的最低检出限、与轮状病毒和腺病毒的交叉反应、批内变异系数及批间变异系数；(6)将所建立的双抗体夹心ELISA检测体系与金标准RT-PCR加测序法比较,对其进行临床应用评价,计算灵敏度、特异度及约登指数。结果：1.抗诺如病毒鸡卵黄抗体IgY的制备(1)改良水稀释法加硫酸铵两次分级沉淀法分离、纯化的抗Nov鸡卵黄抗体的效价在第一次加强免疫后迅速上升,到首次免疫后的第五周效价达到最高为1：51200,后慢慢下降稳定至1：12800。(2) SDS-PAGE结果显示纯度较好,条带主要集中在66KDa和33KDa左右,杂带较少。Western blot结果显示所制备的鸡卵黄抗体IgY可与GⅡ.4型387型菌株Nov P颗粒蛋白抗原发生特异性结合。(3)考马斯亮蓝法测得鸡卵黄抗体IgY溶液的总蛋白含量为7.2mg/ml蛋黄液。(4)理化性质评价结果为不同稀释梯度的鸡卵黄抗体在25℃室温下保存三个月,IgY效价略有下降,但依然可保持较高活性。在60℃及以下的温度环境处理30min后,抗体活性变化不大；在70℃环境温度处理30min时,活性稍有下降；IgY抗体在80℃环境下处理30min后,活性基本消失。鸡卵黄抗体IgY在pH3-12范围内活性基本不受影响,而当pH值≤2或≥12时抗体活性快速下降。IgY抗体在pH≥3的胃蛋白酶作用下,活性稍有下降,在pH≤2的胃蛋白酶作用下,活性消失。IgY抗体在-20℃与4℃之间反复冻融后,活性稍有下降,但幅度较小。2.基于抗诺如病毒鸡卵黄抗体的ELISA检测体系的建立及评价(1)制得的HRP酶标IgY抗体克分子比为1.74,标记率为48.73%。蛋白含量为8.58606mg/ml。(2)对所建立双抗体夹心ELISA体系的各个条件进行优化得最佳包被稀释度和最佳酶标抗体稀释度均为1：80,最优封闭液为2%BSA,封闭时间为1小时,最佳酶标抗体反应时间为30min,最佳底物作用时间为15min。(3)对所建立双抗体夹心ELISA体系进行评价得最低检测限为20ng/ml,批内变异系数为1.021%,批间变异系数为1.150%,与轮状病毒和腺病毒之间存在反应率较低的交叉反应。(4)所建立的双抗体夹心ELISA体系与金标准相比,检出率无统计学差异(P=0.629>0.05),吻合系数Kappa=0.637, P=0.000,吻合度一般。临床应用评价计算得灵敏度为82.50%,特异度为81.82%,约登指数为0.6432。结论：1.以G Ⅱ.4型387型菌株诺如病毒P颗粒蛋白抗原多次多点免疫产蛋来航鸡,成功制备了抗诺如病毒的卵黄抗体IgY,效价最高可达1：51200。2. SDS-PAGE电泳显示,卵黄抗体纯度较高,杂带较少,电泳条带主要集中在66KDa和33KDa处,Western blot显示IgY对蛋白抗原的特异性较好。3.改良水稀释法加硫酸铵两步分级沉淀法分离、纯化鸡蛋黄中的抗Nov特异性IgY,具有简便、快捷、高效的优点,制得的IgY抗体活性较高,适合于IgY的大规模提取。4.获得的IgY抗体对温度、酸碱度的稳定性较好,在室温下稳定。在胃蛋白酶作用下或反复冻融,活性稍有下降。5.用HRP标记卵黄抗体IgY,成功制备了以IgY为基础的酶标抗体。6.以特异性抗Nov抗体IgY作为包被抗体,以酶标抗体为捕获抗体,建立了用于检测Nov的双抗体夹心ELISA体系。对其条件进行优化,结果如下：(1)包被抗体与捕获抗体的最佳工作稀释浓度均为1：80。(2)封闭液选取：2%BSA,封闭时间：1小时。(3)酶标抗体最佳反应时间：30分钟。(4)底物最佳作用时间：15分钟。7.所建立双抗体ELISA检测体系最低检测限为20ng/ml,批内变异系数为1.021%,批间变异系数为1.150%,与轮状病毒和腺病毒之间存在反应率较低的交叉反应。8.与金标准相比,检出率无统计学差异,Kappa=0.637。临床应用评价计算得灵敏度为82.50%,特异度为81.82%,约登指数为0.6432。