一、研究背景慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一种多因素共同参与的炎症过程,胰腺小叶内或小叶间纤维组织大量增生累及胰腺实质和胰管结构,导致胰腺内外分泌功能受损,其特征是胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化,合成并释放大量细胞外基质蛋白、炎症介质和细胞因子,引起胰腺组织进行性纤维化。许多分子和信号转导途径参与了PSCs的激活和功能调节,包括过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)、细胞外信号调节激酶(extra-cellular signal-regulated kinase, ERK)和Smads蛋白途径,它们的刺激物分别是PPAR-γ配体、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)和转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)等,其中TGF-β1是PSCs活化和细胞外基质合成的主要刺激物,是CP进展中的重要细胞因子。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)属核激素受体家族的成员,是通过配体激活的转录因子,包括PPAR-a, PPAR-β、PPAR-d和PPAR-γ,其中PPAR-γ是PPARs中研究最为广泛的一种亚型,在调节炎症应答、脂质合成、糖代谢以及各种细胞的分化、增殖和凋亡途径中发挥重要作用,其中PPARγ通过抑制炎症应答基因的表达而发挥抗炎作用的。研究发现,无论是发病早期还是进展期,PPAR-γ激动剂曲格列酮能够抑制CP进程中TGF-β1诱导的胰腺星状细胞(Pan-creatic Stellate Cells, PSCs)的活化,阻止纤维化进程。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是一种经典的循环激素系统,主要通过生理性血管紧张素Ⅱ的产生对血压、体液和电解质平衡发挥重要的调节作用。现已证实许多组织和脏器存在各自具有活性的RAS产物,并通过旁分泌和自分泌的方式特异性调节各脏器的功能。胰腺局部同样存在RAS,它在胰腺的生理和病理生理过程中发挥重要作用,其生物功能是通过AngⅡ1型和2型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor and type 2 receptor, AT1R and AT2R)来介导的,其中大多数是通过ATlR介导的,激活的血管紧张素Ⅱ与ATlR介导氧化应激、诱导炎症反应、细胞凋亡和组织纤维化。关于AT2R的作用,目前研究尚不深入。在正常生理状态下,AngⅡ与AT-2R结合,介导血管收缩、降低肾小管对钠的重吸收,改善上皮细胞功能,抑制细胞生长和结缔组织沉积,AT-2R的这些效应是通过调节受体表达实现的。在应激状态下,血管紧张素受体拮抗剂(Angiotensin receptor blockers, ARB)通过AngⅡ抑制AT-1R的激活,反馈性促进AngⅡ的合成并激活AT-2R。应激时,AT-2R在胰腺、心脏、肾脏、脑、肾上腺和脉管系统呈现表达,发挥上述作用,维持机体内环境的平衡。最近有文献报道：与携带野生型AT-2R基因的CP小鼠比较,AT-2R基因敲出小鼠CP胰腺纤维化程度减轻,表明AT-2R具有抗纤维化作用。RAS阻断的最基本效应是抗炎症反应,可能有助于阻止胰腺炎症和糖尿病的进展。有研究显示,在WBN/Kob大鼠自发性慢性胰腺炎模型中,坎地沙坦,一种AT1R拮抗剂,通过抑制TGF-β1的过表达,阻止PSCs的激活,改善CP的炎症和纤维化程度。与野生型相比,在雨蛙素诱导的小鼠CP模型中,AT1R缺陷小鼠胰腺纤维化和PSCs激活的程度明显降低,TGF-β1 mRNA水平也较低,提示AT1R途径在PSCs活化、增殖所致的胰腺纤维化进程中发挥重要作用。替米沙坦是一种AT1R拮抗剂,能够阻断AT1R,并部分激动PPAR-γ,这种双重作用在理论上更有利于抑制慢性炎症和纤维化的进展。有研究报道,Tel通过降低磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)活性,抑制(纤)丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)的形成和细胞间粘附分子(intercellular adhesion mole-cule3,ICAM3)的易位,最终抑制趋化因子诱导的CD4阳性淋巴细胞迁移。Tel的这一作用是通过PPAR-γ、而不依赖于AT1R,提示Tel抗炎作用的发挥有赖于PPAR-γ。同样也是体外实验发现,Tel通过激活PPAR-γ抑制AT1R基因的表达,这种对血管紧张素Ⅱ功能的双重抑制,有助于更完全地抑制肾素.血管紧张素系统,为CP的治疗提供了更好的手段。本研究将探讨Tel改善大鼠CP的作用及其机制,为CP的临床治疗提供理论基础。二、研究内容第一部分建立慢性胰腺炎大鼠模型目的建立CP大鼠模型,在此基础上进行药物干预,并观察大鼠CP病变形成过程中a-SMA和PPAR-γ蛋白表达的变化。方法经大鼠尾静脉一次性注射二丁基二氯基锡(dinbutyltin dichloride, DBTC),按体重值随机分为模型组,包括1天组、3天组、5天组、1周组、2周组、6周组,模型对照组大鼠尾静脉注射有机溶剂,通过HE染色了解组织学改变,Sirius Red染色后应用图像定量分析系统测定胶原含量,全自动生化仪测血淀粉酶(amylase, AMS)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),分光光度仪测定胰腺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性。Envision免疫组化半定量方法测定a-SMA和PPAR-γ蛋白的表达。结果HE染色,造模1周内组织学呈急性胰腺炎病理改变,第2周导管周围出现胶原沉积,第6周出现不同程度的腺泡坏死、萎缩,淋巴细胞、单核细胞浸润,小叶内或小叶周围纤维化形成,伴胰管改变,胰岛始终未累及；Sirius Red染色,模型组图像半定量分析峰值在第1周,2周后维持在较高水平,胶原沉积在导管周围至小叶内和/或小叶周围,模型对照组仅见血管壁胶原沉积；模型组血AMS峰值在第3天、第5天,之后渐降,血ALT峰值在第1天、第2周,之后渐降至正常,血ALP峰值在第3天、第2周,之后渐降至正常,模型对照组各值在正常范围；模型组胰腺组织髓过氧化物酶MPO活性峰值在第1天、第5天,之后维持在轻度升高水平,模型对照组MPO活性值在正常范围。模型对照组中,a-SMA蛋白仅在血管壁和导管壁呈阳性表达；模型时,a-SMA蛋白最初位于血管壁、导管壁,渐累及小叶内和／或小叶间区域,1周内表达显著升高,第2周略有下降,至第6周维持在较高水平,与胶原沉积的动态变化相一致；模型对照组中,PPAR-γ呈阴性表达,模型时PPAR-γ蛋白在病程第3天呈阳性表达,至第6周表达渐增强。结论根据组织学评分各项指标、Sirius Red染色胶原含量和胰腺组织髓过氧化物酶MPO活性测定的动态变化确定大鼠CP模型的建立。根据a-SMA蛋白表达,判断PSCs激活的时间和程度,为药物干预时间点的选择提供依据；随着大鼠CP的病程进展,PPAR-γ蛋白表达渐增强,与病情呈正相关。第二部分替米沙坦改善大鼠慢性胰腺炎的作用机制探讨目的将大鼠随机分为正常对照组、正常+Tel (8.33mg/kg)组、CP组、CP+早期大剂量Tel组、CP+早期小剂量Tel组、CP+晚期大剂量Tel组、CP+晚期小剂量Tel组,观察Tel对大鼠CP的作用,其中早期是指造模的同时给予Tel,晚期是指造模2周后给予Tel,大剂量是指8.33mg/kg,小剂量是指4.17mg/kg。观察替米沙坦对大鼠慢性胰腺炎的影响,并探讨其机制。方法HE染色了解各组组织学评分变化,Sirius Red染色后应用图像定量分析系统测定胶原含量,分光光度仪测定各组胰腺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性,放免法测各组血清胰岛素(insulin, INS)水平。Envision免疫组化半定量方法测定各组a-SMA、PPAR-γ、AT1R和AT2R蛋白的表达,实时定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction, RT-PCR)测定各组TGF-β1和PPAR-γ在RNA水平的表达。结果HE染色组织学评分结果,CP+早期大剂量Tel组、CP+晚期大剂量Tel组各指标较CP组明显改善(P<0.05),CP+早期小剂量Tel组、CP+晚期小剂量Tel组各指标较CP组无改善(P>0.05); Sirius Red染色测定胶原含量,CP+早期大剂量Tel组、CP+晚期大剂量Tel组较CP组明显改善(P<0.05),CP+早期小剂量Tel组、CP+晚期小剂量Tel组较CP组无改善(P>0.05);胰腺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性测定,CP+早期大剂量Tel组、CP+晚期大剂量Tel组较CP组明显降低(P<0.05),CP+早期小剂量Tel组、CP+晚期小剂量Tel组较CP组无改善(P>0.05);血清胰岛素(insulin, INS)水平,各组间无统计学差异。a-SMA, PPAR-γ、AT1R和AT2R蛋白的表达,CP+早期大剂量Tel组、CP+晚期大剂量Tel组较CP组明显下降(P<0.05),CP+早期小剂量Tel组、CP+晚期小剂量Tel组较CP组无改善(P>0.05),正常对照组与正常+Tel组之间这四种蛋白的表达无差异(P>0.05);TGF-β1和PPAR-γ在RNA水平的表达,CP+早期大剂量Tel组、CP+晚期大剂量Tel组较CP组明显下降(P<0.05),CP+早期小剂量Tel组、CP+晚期小剂量Tel组较CP组无改善(P>0.05),正常对照组与正常+Tel组之间TGF-β1和PPAR-γ在RNA水平的表达无差异(P>0.05)。结论在造模同时以及造模2周后给予大剂量Tel,均能够改善大鼠胰腺炎症和纤维化程度。其机制可能与下调AT1R、减少TGF-β1的产生和PSCs的激活相关；Tel在体内对PPAR-γ的影响,不是通过增加它在蛋白和RNA水平的表达,可能通过PPAR-γ的构象改变、增强其与相应配体的亲和力来促进PPAR-γ发挥抗炎症反应作用的。