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目的:探索诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)分化为肝细胞的最适条件,并研究NF-κB和Ubc9在肝样定向分化中的表达,为BMSCs定向分化的分子生物学机制提供理论依据。方法:用全骨髓法从小鼠双侧股骨、胫骨骨髓中分离骨髓,贴壁法培养、扩增和纯化BMSCs。向体外传代扩增的BMSCs培养液中加入1g/L新生小鼠肝脏提取液(G)与胎肝细胞培养上清液(conditioned-medium,CM),以模拟肝细胞在体内生长的微环境;另外,在培养液中分别加入终浓度为30μg/L的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、50μg/L 的β-神经生长因子(β-nerve growth factor,β-NGF)、0.3g/L的维甲酸(retinoicacid,RA)作为单一诱导条件,对比不同诱导方案诱导BMSCs向肝样细胞定向分化的效果,阴性对照组不加诱导剂。显微镜下随时观察细胞形态变化,诱导14d、21d后,收取细胞,免疫荧光法检测各处理组肝细胞特异性蛋白α1-抗胰蛋白酶(AAT)和NF-κB和Ubc9蛋白的表达情况。结果:(l)BMSCs接种48 h见不规则形的细胞贴壁增多。随着培养的时间延长,不仅贴壁细胞数量逐渐增加,细胞呈现出长梭形、多角形等不同的形状,呈细胞聚集样分布趋势,大约培养9-12d细胞达到80%-90%密度时传代,第3代(P3)后细胞呈现内皮细胞样或成纤维细胞样的梭形或纺锤形,形态大体一致,呈漩涡状或平行状排列。(2)不同方案诱导7d时细胞大部分仍然为梭形状形态,仅很少量的细胞呈现圆形或卵圆形;随着诱导时间的延长,细胞由梭形或成纤维细胞样细胞逐渐变成纺锤状、不规则、圆形或卵圆形细胞。(3)免疫荧光检测结果显示,随着诱导时间的延长细胞形态逐渐呈现缩短变圆的趋势,其中主要是圆形细胞α1-抗胰蛋白酶(αα1-antitrypsin AAT)呈阳性表达。与对照组相比,G、CM、β-NGF、HGF、RA诱导14d,21d后,AAT均呈阳性表达,其中G、CM、β-NGF、HGF组卵圆形或圆形细胞数量多,AAT阳性细胞表达率高。与对照组比较,G、CM、β-NGF、HGF、RA诱导14d、21d后,BMSCs向肝细胞分化过程中细胞形态逐渐发生变化,NF-κB、Ubc9的表达随着分化细胞形态的变化胞质与胞核均呈逐渐上升趋势,强阳性细胞主要为圆形细胞,其中G、CM、HGF、β-NGF组表达强于RA组,诱导过程中部分细胞的NF-κB表达由胞质转向胞核,而Ubc9在诱导过程中主要在胞质中表达。结论:体外G、CM、NGF、HGF、RA可诱导BMSCs向肝样细胞定向分化。NF-κB和Ubc9在诱导分化过程中均呈阳性表达。