实验目的:阻塞性黄疸(Obstructive jaundice,OJ)是临床上常见并发症,胆道系统的良、恶性梗阻、手术损伤等均可导致OJ并随即出现严重的多脏器损伤。目前认为阻塞性黄疸(OJ)可诱导肝脏、脾脏、淋巴细胞、胃肠黏膜以及心脏血流动力学障碍等功能损害。但是,OJ时引起多脏器损害的内在机制还不清楚。普遍认为,内毒素、炎症介质、以及胆汁酸升高诱发OJ时肝或其他器官损伤。此外,高胆管内压力和门静脉压力,也是造成这一伤害的重要因素。近年来随着细胞凋亡研究的深入,已发现许多肝胆系统疾病与细胞凋亡规律失常有关,细胞凋亡在维持肝胆系统正常生理状态和内环境稳定中起着十分重要的作用。研究认为细胞凋亡参与OJ多脏器功能损伤的发病机制有两种:一是受基因调控,另一种是受非基因调控;基因调控又分为直接调控和间接调控,前者包括p53、Bax、Fas-Fasl、Bcl-2等,后者如TGF、TNF、NF-κB等。其中,Bax是一种可溶性蛋白质,正常情况下以单体形式定位于细胞浆,当收到凋亡刺激时构象发生变化,从细胞浆转位至线粒体并与线粒体外膜结合,直接降低线粒体外膜稳定性或与Bcl-2结合成异源二聚体的结构,发挥促进细胞凋亡的作用。NF-κB是一种广泛存在于多种细胞细胞质中的具有细胞核基因转录调节作用的蛋白质因子,是转录调节蛋白Rel家族成员之一,参与多种炎性因子基因表达的调控及细胞凋亡等多种病理生理过程。当机体细胞处于氧自由基水平升高、缺血-再灌注损伤、内毒素血症等应激状态下,I-κB可使NF-κB活化易位进入细胞核并结合于靶基因特异的启动子区域的κB基因序列结合,从而启动促炎症分子基因的转录核蛋白质的合成,引起TNF-α、IL-6mRNA等的强烈表达,产生大量的炎性细胞因子,同时间接促使凋亡细胞增加,加速对脏器细胞的毒性作用并最终出现多器官功能损伤。有实验证实Bax蛋白、NF-κB蛋白明显高表达时,梗阻性黄疸大鼠肝肾组织细胞凋亡明显增多。现今研究发现,NF-κB亚单位的种类及数量在细胞凋亡中起着决定性的作用,当c-RelA亚型表达增加时,则促进凋亡的发生。药物治疗OJ多脏器功能损害能否通过调控脏器细胞凋亡从而获得疗效正引起研究者的兴趣。丹参是一种传统中药,通常用于活血治疗。丹参是野生丹参根的提取物,主要活性成分包括丹参素,丹酚酸以及丹参酮等,能够起到保护内皮细胞,对抗炎症,防止脂质过氧化和钙超载的作用。研究表明,丹参治疗OJ大鼠时通过降低内毒素水平、减少炎症介质等已经得到普遍认同的机制,发挥保护肝细胞,维护肝功能,以及减少对肾皮质和肾功能损害的作用。但是丹参是否通过抗细胞凋亡的分子机制起到治疗作用,尚无进一步研究。本研究的目的就是为了弥补这个不足。通过观察丹参对阻塞性黄疸大鼠(OJ)肝脏细胞、肾脏细胞凋亡和Bax、NF-κB蛋白表达的影响,探讨丹参对肝脏、肾脏的保护机制。方法:1.取雄性清洁级健康SD大鼠180只进行实验(体重270～330g)。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物许可证号:SCXK(沪)2007-0005]。于浙江中医药大学实验动物中心屏障系统实验室饲养[实验动物许可证号:SYXK(浙)2007-0003]。大鼠实验前适应性饲养1周,术前禁食12h,自由饮水。2.将大鼠随机均分为假手术组(n=60)、模型组(n=60)、丹参治疗组(n=60)。假手术组仅游离大鼠胆总管而不结扎,然后分层关腹。模型组和丹参治疗组游离大鼠胆总管后用丝线双重结扎胆总管近端,并切断胆总管,分层关腹。丹参治疗组组按每只0.2ml/100g/d腹腔内注射丹参注射液,而假手术组、模型组每日注射等量的生理盐水。按术后不同时间段各组分为OJ 7d、14d、21d、28d组(n=15)。3.记录术后各相应时点大鼠的一般情况,包括大鼠活动度、精神状况、大小便颜色及是否改变、眼白及皮毛染色有无改变,死亡率等。4.检测各组、各时间点血清TBIL、DBIL、γ-GT,BUN、CREA含量,通过对大体标本肉眼观察、光镜法及电镜法观察各组、各时间点肝脏、肾脏组织病理改变特征,判断大鼠阻塞性黄疸模型建立是否成功,以及运用丹参治疗后与模型组一般情况、血清指标、病理变化来判断治疗效果。5.运用组织芯片技术制作肝、肾组织微阵列切片。采用组织微阵列片制作机(Beecher Instruments,USA)制备肝、肾的组织微阵列片,将100个直径2毫米的小组织样本,以阵列方式包埋于同一块20mm×45 mm的石蜡块中,再进行切片,用于同一实验指标的研究。6.在制作完成的肝肾组织微阵列切片上通过DNA缺口原位末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数。在微阵列切片上进行TUNEL染色,高倍镜下(400倍)观察凋亡细胞的分布。每张切片随机选择5-10个高倍视野,计数1000个细胞中的凋亡细胞个数,用百分数表示,计算凋亡指数(AI),AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。本部分工作在陕西超英生物科技有限公司完成。7.在制作完成的肝肾组织微阵列切片上通过免疫组化检测组织切片中Bax、NF-κB c-RelA蛋白表达水平。在微阵列切片上采用二步EnVision法,计分标准如下:1)按着色细胞染色强度计分为:细胞呈阴性染色为-;染色弱,阳性细胞呈淡黄色为+;染色中等,阳性细胞呈棕黄色为++;染色强,阳性细胞呈棕褐色为+++。2)阳性细胞数(面积):无阳性细胞数为-;阳性细胞数＜25%为+;阳性细胞数25～50%为++;阳性细胞数＞50%为+++。结果:1.假手术组21d死亡1只,其余时间点无死亡;模型组7d死亡2只,14d死亡4只,21d死亡4只,28d死亡7只;丹参治疗组7d无死亡,14d死亡3只,21d死亡2只,28d死亡4只。7d三组间死亡率无统计学差异,14d、21d假手术组与模型组间死亡率均存在统计学差异(P=0.032),28d假手术组与模型组间死亡率存在统计学差异(P=0.006),假手术组与治疗组间死亡率存在统计学差异(P=0.032)。2.各时间点假手术组TBIL、DBIL、γ-GT和CREA含量明显小于模型组与治疗组(P＜0.01);OJ 21、28d治疗组大鼠血清TBIL、CREA含量均明显低于模型组(P＜0.05 or P＜0.01);OJ 28d治疗组大鼠血清DBIL含量均明显低于模型组(P＜0.01),OJ 21d治疗组大鼠血清γ-GT含量均明显低于模型组(P＜0.01)。3.大体、光镜及电镜观察下,OJ丹参治疗组大鼠的肝脏、肾脏病理改变较模型组均不同程度地减轻。4.肝脏凋亡指数在21d丹参治疗组明显低于模型组(P＜0.01),其余各时间点各组间无显著性差异。肾脏凋亡指数14d模型组明显大于假手术组(P＜0.01),各时间点丹参治疗组与假手术组无明显差异(P＞0.05),14d丹参治疗组明显小于模型组(P＜0.01)。5.肝脏Bax蛋白阳性强度以及阳性强度和面积的乘积在各时间点模型组明显大于假手术组(P＜0.01),7,21,28天时间点丹参治疗组明显大于假手术组(P＜0.01),各时间点丹参治疗组与模型组无显著性差异(P＞0.05)。肝脏NF-κB c-RelA蛋白阳性强度以及阳性强度和面积的乘积在7d、14d、21d模型组明显大于假手术组(P＜0.01),各时间点丹参治疗组与假手术组、模型组无显著性差异(P＞0.05)。肾脏Bax蛋白阳性强度21d模型组明显大于假手术组(P＜0.01),各时间点丹参治疗组与假手术组、模型组无明显差异(P＞0.05)。肾脏Bax蛋白阳性强度和面积乘积21d模型组明显大于假手术组(P＜0.01),各时间点丹参治疗组与假手术组无明显差异(P＞0.05),21d丹参治疗组明显小于模型组(P＜0.01)。肾脏NF-κB c-RelA蛋白阳性强度以及阳性强度和面积的乘积在各时间点假手术组与模型组、丹参治疗组以及模型组与丹参治疗组之间均无明显差异(P＞0.05)。结论:1.结扎大鼠胆总管后,模型组及丹参治疗组大鼠血清TBIL、DBIL及γ-GT浓度均较未结扎胆总管的假手术组明显升高,且血清胆红素以DBIL为主;同时模型组及丹参治疗组大鼠血清BUN、CREA浓度也均较假手术组明显升高,且肝肾组织有显著的病理损伤表现,说明阻塞性黄疸在肝功能受损同时也可导致肾功能损伤。2.阻塞性黄疸大鼠可出现肝、肾组织Bax蛋白、肝脏NF-κB c-RelA蛋白表达明显升高,肝、肾组织凋亡细胞指数明显增加。3.丹参能明显地降低OJ大鼠血清TBIL、DBIL、γ-GT及CREA含量,减少肝肾细胞凋亡数目,减轻肝脏、肾脏病理损伤,降低大鼠死亡率。4.丹参对OJ大鼠肝、肾组织NF-κB c-RelA蛋白表达无明显的调节作用。丹参可能通过抑制OJ大鼠肾脏Bax蛋白的表达,减轻肾脏细胞的凋亡,对肾功能起到积极的保护作用。