目的：lgA肾病是亚太地区最常见的原发性肾小球疾病,是终末期肾衰竭的主要原因。约40％IgA肾病患者在确诊后20年内进入肾功能不全,长期预后差。目前IgA肾病的发病机制尚未十分清楚,缺乏特异性的治疗方法。肾内氧化应激在IgA肾病的进展过程中发挥着重要作用,多个研究证实抗氧化剂治疗对IgA肾病有效。　　 肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)是一种在人类近曲小管上皮细胞表达的蛋白质(分子量为14.4 kD),可以调节细胞对脂肪酸的摄取、转运和代谢,并可调控脂质代谢相关基因的表达;它对长链脂肪酸的氧化产物具有高度的亲和性,是一种重要的细胞抗氧化因子。近期的研究表明肾小管高表达的L-FABP抑制了肾小管间质的氧化应激,发挥了肾脏保护作用,但L-FABP在肾小球疾病中的病理生理作用尚未见研究报道。本研究旨在探讨肾小管L-FABP在IgA肾病的发病过程中所发挥的病理生理作用及其作用机制。　　 本试验从以下三个方面进行了研究:1.肾小管L-FABP在小鼠IgA肾病中的表达变化;2.L-FABP对小鼠IgA肾病中肾小球损伤的保护作用;3.系膜细胞源性TNF-α上调IgA肾病肾小管L-FABP的表达及其保护作用。　　 材料与方法：　　 第一部分、IgA肾病发病ddY鼠作为供体(由日本顺天堂大学医学部实验动物中心提供),11～14周龄人类L-FABP(hL-FABP)转基因(Tg)鼠(n=19)和C57BL/6的野生(WT)鼠(n=19)作为受体行骨髓移植。受体鼠暴露到身体X线照射后,经尾静脉注射途径移植骨髓干细胞。WT受体鼠(WT/ddY组)和Tg受体鼠(Tg/ddY组)均在移植后第6周(n=6)和12周(n=10)留取血尿标本后分批处死。正常Tg和WT鼠作为对照组。小鼠血清IgA和尿hL-FABP的浓度测定均采用ELISA法。经代谢笼收集24h尿液。尿hL-FABP水平以尿L-FABP(ng)/尿肌酐(mg)的比值表示。本部分主要用免疫荧光(IF)染色的方法观察肾小球系膜区IgA的沉积,免疫组化,Western印迹和实时荧光定量PCR法观察骨髓移植对hL-FABP肾脏表达的影响。　　 第二部分、IgA肾病发病ddY鼠作为供体(由日本顺天堂大学医学部实验动物中心提供),11～14周龄Tg鼠(n=19)和C57BL/6的WT鼠(n=19)作为受体行骨髓移植。受体鼠暴露到身体X线照射后,经尾静脉注射途径移植骨髓干细胞。两组受体鼠(WT/ddY组和Tg/ddY组)均在移植后第6周(n=6)和12周(n=10)留取血尿标本后分批处死。正常Tg(n=3)和WT(n=3)鼠作为对照组。小鼠在处死前留尿测24h尿蛋白定量,处死时留取血和肾组织标本。肾组织切片做PAS染色进行肾脏病理组织改变的评分,ELISA法测尿蛋白定量,并用Western印迹法检测肾小球蛋白Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ),纤维连接蛋白(FN)及肾脏4-HNE和HO-1的表达,免疫组化法检测肾小球浸润的CD68+细胞数目;实时荧光定量PCR法检测肾脏MCP-1的mRNA表达。　　 第三部分、原代培养C57BL/6小鼠的系膜细胞。细胞在含20％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和5μg/ml胰岛素-转铁蛋白-钠亚硒酸盐培养液补充物的RPMI1640培养液中于37℃、5％CO2孵育箱中孵育。0.25％胰蛋白酶消化,传代培养。mProx和mProx-L均在含10％FCS的DMEM培养液中于37℃、5％CO2孵育箱中孵育。小鼠IgA在63℃加热150分钟得到多聚IgA(AIgA)。生长停止的MCs(1×106)与不同浓度的AIgA(AIgA终浓度为10～250μg/ml)共同孵育48h。孵育后收集上清作为.AIgA-MC条件介质保存在-80℃。没有添加AIgA的RPMI1640培养液孵育MC得到的上清作为空白对照。所有的实验培养细胞长到亚融合状态时加入含有0.5％FCS培养液在实验开始前同步化16h。进行下列实验:(1)mProx和mProx-L细胞(1×106)与10倍稀释的AIgA-MC条件介质在DMEM培养液中孵育12h或24h。(2)与中和性抗TNF-α抗体(0.1～5μg/ml)预孵育1h后再加入AIgA-MC介质共同孵育24h。(3)与重组的鼠TNF-α(2～250ng/ml)孵育24h。用实时荧光定量PCR法检测细胞的hL-FABP和MCP-1的mRNA表达,用Western印迹法检测细胞的hL-FABP和4-HNE的蛋白表达。　　 数据处理:应用SPSS13.0软件进行数据统计,所有数据均以均数±标准差表示,两组间差异显著性比较用t检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。　　 结果：　　 第一部分、(1)骨髓移植后Tg/ddY组和WT/ddY组均出现了系膜区IgA的沉积,第12周IgA的系膜沉积明显增多,两组间差异无统计学意义。(2)两组小鼠血清IgA水平在骨髓移植后均明显升高,组间差异无统计学意义。(3)hL-FABP肾脏表达:免疫组化显示在正常Tg鼠肾脏,hL-FABP弥散地表达在近曲小管上皮细胞的胞浆中。Tg/ddY组hL-FABP的阳性染色主要分布于近曲小管上皮细胞的胞浆和细胞核。与正常对照组相比,Tg/ddY组肾脏hL-FABP的mRNA(P＜0.001)和hL-FABP的蛋白表达水平(P＜0.01)均在第6周显著升高。尿中hL-FABP水平在第6周时也显著升高(59.87±26.75比31.01±14.86μg/g肌酐,P＜0.05)。　　 第二部分、(1)骨髓移植后第6周,Tg/ddY组的尿白蛋白水平明显低于WT/ddY组(P＜0.05)。第12周WT/ddY组尿白蛋白水平急剧升高,达到82.8±65.6mg/dL,而Tg/ddY组的尿白蛋白水平仍然保持一个较低的水平(8.2±2.2 mg/dL,P＜0.005)。骨髓移植后第12周与Tg/ddY组相比,WT/ddY组肾小球FN(P＜0.05)和ColⅣ(P＜0.0005)蛋白的沉积显著增加;肾小球浸润的CD68+细胞数目显著增多(P＜0.05);并出现了更高肾小球病理学评分(P＜0.0005)和更显著的系膜基质扩张(P＜0.01)。(2)应用Western印迹法在正常对照组及第12周WT/ddY和Tg/ddY组的肾脏中均未发现HO-1的表达。但第6周,两组受体鼠的肾脏均出现了HO-1表达,Tg/ddY组HO-1的表达水平显著低于WT/ddY组(P＜0.05)。正常对照组和第6周WT/ddY和Tg/ddY肾脏中均未检测到4-HNE修饰蛋白的表达。WT/ddY和Tg/ddY组的肾脏4-HNE修饰蛋白的聚集均出现在第12周,Tg/ddV组肾脏4-HNE的聚集水平显著低于WT/ddY组(P＜0.05)。WT/ddY组肾脏MCP-1mRNA的表达水平在第12周显著上调(P＜0.005),显著高于Tg/ddY组(P＜0.01)。　　 第三部分、(1)实时荧光定量PCR显示:不同浓度的AIgA-MC条件介质与空白对照相比,可以诱导hL-FABP mRNA表达显著上调(P＜0.005);而相同浓度的AIgA单独刺激后,hL-FABP mRNA表达水平的没有明显变化。Western印迹显示:不同浓度的AIgA-MC条件介质刺激mProx-L细胞后,与对照空白相比,均可以诱导hL-FABP蛋白表达水平显著上调(P＜0.00),而AIgA直接刺激后,hL-FABP的蛋白表达水平无明显变化。(2)中和性抗TNF-α抗体与mProx-L预孵育1h后,加入AIgA-MC条件介质共同孵育24h。Western印迹显示:AIgA-MC介质刺激后,hL-FABP的蛋白表达显著上调(P＜0.01);中和性抗TNF-α抗体(终浓度1μg/ml和5μg/ml时)显著地抑制了hL-FABP蛋白表达的上调(分别为P＜0.05和P＜0.01)。(3)Western印迹显示重组小鼠TNF-α可以显著上调mProx-L细胞hL-FABP的蛋白表达水平(P＜0.005)。(4)AIgA-MC条件介质分别刺激mProx-L和mProx细胞后,mProx细胞的4-HNE修饰蛋白表达水平显著上调(P＜0.05),而mProx-L细胞刺激前后4-HNE修饰蛋白表达水平无显著变化;但刺激后mProx-L细胞的4-HNE修饰蛋白表达水平显著低于mProx细胞(P＜0.05)。刺激后,两种细胞的MCP-1mRNA表达水平与刺激前比较均明显上调(P＜0.001):但mProx-L细胞的MCP-1mRNA表达水平显著低于mProx细胞(P＜0.001)。　　 结论：　　 本研究结果表明:　　 1、骨髓移植后的第6周和第12周,WT/ddY组和Tg/ddY组小鼠的肾小球系膜区均出现IgA沉积,血清IgA水平较移植前显著升高,Tg/ddY组小鼠hL-FABP的mRNA水平和蛋白水平显著升高,证明本IgA肾病模型造模成功,且L-FABP在本IgA肾病模型中的表达上调。　　 2、骨髓移植后,Tg/ddY组小鼠的肾脏4-HNE,HO-1和MCP-1水平显著低于WT/ddY组小鼠;而且其肾小球损伤病理评分,肾小球CD68+细胞的浸润数目,肾小球FN和ColⅣ蛋白的沉积水平及尿蛋白水平均显著低于WT/ddY组小鼠。说明L-FABP可以显著抑制肾脏的氧化应激和炎症反应,减轻肾小球损伤,在IgA肾病的早期发挥肾脏保护性作用。　　 3、体外实验证明:IgA-MC介质可显著上调hL-FABP的表达,而AlgA直接刺激不能上调其表达。中和性抗TNF-α抗体的预孵育可以显著抑制这种上调效应,且重组鼠的TNF-α可以呈剂量依赖性上调hL-FABP的表达。上调后的L-FABP可以抑制细胞的氧化应激和炎症反应。证明IgA肾病系膜细胞源性TNF-α可以诱导肾小管L-FABP表达的上调,进而抑制氧化应激和炎症反应,发挥肾脏保护作用。　　 4、L-FABP在近曲小管的高表达对小鼠IgA肾病肾脏保护作用与其抗氧化潜能相关,这提示近曲小管氧化应激的抑制可能改善IgA肾病的进展,特别是在早期阶段。上调肾小管L-FABP表达的药物可能减缓IgA肾病的进展。这为IgA肾病的治疗策略提供了新的理论依据。