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研究背景及目的:妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）是一种发生在妊娠期的代谢综合征,它增加了胎盘发育不良的风险。GDM患者常合并低脂联素血症和高水平中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。脂联素（adiponectin,APN）负向调节中性粒细胞功能,抑制中性粒细胞激活、NADPH氧化酶活化。激活的中性粒细胞依赖NADPH氧化酶活化产生的大量ROS释放NETs,此过程称为NETosis。NETs是由染色质和颗粒蛋白:髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）、组蛋白酶（citH3）组成的细胞外纤维结构。虽然已经证明高糖（highglucose,HG）可诱导NETosis,但是GDM患者体内高水平NETs的原因错综复杂,根据以上研究我们推测或许它也与低脂联素血症有关。滋养细胞凋亡在GDM患者中明显增加,抑制滋养细胞凋亡能显著降低流产和子痫前期的发生率。NETs与胎盘功能不全有关,但NETs是否促进滋养细胞凋亡尚未明确。本研究拟探索在HG环境中APN水平对NETs生成的影响以及NETs对滋养细胞生物学功能的损害。材料和方法:1.本文将GDM和健康孕妇各20例纳入研究。诊断依据妊娠24-29周进行的口服葡萄糖耐量试验（OGTT）,所有志愿者入组时均没有接受任何治疗,均获得知情同意,研究经医院伦理委员会批准。2.我们通过Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Reagent and Kits试剂盒定量检测GDM和健康孕妇血清细胞游离DNA（cell free-DNA,cf-DNA）水平、ELISA法分析血清APN、NE、MPO、MPO-DNA复合物的浓度,比较两组APN、NETs标志物水平。3.通过体外实验定量检测cf-DNA、活细胞荧光染色技术判断NET%、细胞免疫荧光共定位DNA/MPO/NE、ELISA和western blot法检测NETs标志物水平评估HG条件下人重组脂联素（human recombinant adiponectin,HAP）调控NETs生成的情况。4.运用DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测ROS,揭示HAP通过NADPH氧化酶/ROS途径调控NETs生成。5.western blot技术探索ERK1/2、p38MAPK信号通路在HAP调控NETs生成过程中发挥的作用。6.提取NETs:体外HG诱导中性粒细胞生产NETs,提取NETs并检测cf-DNA浓度。7.向经或未经ROS清除剂NAC预处理的滋养细胞中加入NETs培养24小时后,运用CCK-8分析滋养细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡率、western blotting评估线粒体途径相关的凋亡蛋白表达量、ROS定量等实验方法评价NETs对滋养细胞的凋亡作用及相关机制。结果:1.GDM孕妇体内存在低水平APN和高水平NETs。与同孕周健康孕妇比,GDM患者血清中APN水平降低,NETs标记物:cf-DNA、MPO、NE、MPO-DNA复合物水平升高。2.GDM患者的中性粒细胞自发生成NETs能力增强。通过cf-DNA定量和活细胞荧光染色,发现与健康孕妇相比GDM患者释放NETs的中性粒细胞比例较高。3.HG通过NADPH氧化酶/ROS途径诱导中性粒细胞生成NETs。HG可活化中性粒细胞生成大量ROS和NETs,其水平与阳性对照PMA相当,应用DPI（NADPH氧化酶抑制剂）预处理中性粒细胞后HG诱导的ROS和NETs生成量明显减少。4.HAP通过抑制NADPH氧化酶/ROS途径阻断中性粒细胞生产NETs。HAP预处理后,中性粒细胞在HG条件下ROS和NETs生成量显著减少。5.HAP通过抑制ERK1/2、P38MAPK信号通路传导阻断HG诱导的NETs生成。我们采用Western blot的实验方法发现HG促进中性粒细胞ERK1/2、p38MAPK磷酸化。HAP预处理中性粒细胞可以抑制p-ERK1/2和p-p38MAPK的表达。6.NETs通过ROS/线粒体途径促进滋养细胞凋亡。HG诱导的NETs可促使HTR-8/SVneo细胞生成大量ROS、损伤细胞活力、增加细胞凋亡率、上调线粒体途径促凋亡蛋白表达,NAC可以明显减少ROS生产,修复细胞活力,抑制细胞凋亡率,下调促凋亡蛋白表达。7.DNase Ⅰ可拮抗NETs促进滋养细胞凋亡的作用。8.HG诱导生成的NETs通过抑制ERK1/2信号通路传导促进滋养细胞凋亡。Western blot分析显示,NETs处理后的HTR-8/SVneo细胞p-ERK1/2的表达显著降低。结论:在HG条件下低脂联素血症是GDM患者高水平NETs的原因。NETs可诱导滋养细胞发生ROS依赖性的线粒体途径凋亡,影响胎盘发育,造成不良妊娠结局。因此纠正低脂联素血症或许能阻断NETs生成,有望成为治疗GDM的新靶点。