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近年来,随着环境污染和社会变迁,人类的生育能力呈现下降趋势,不孕不育患病率逐年升高,生殖障碍已成为全社会关注的重点问题之一。全世界约有10%-15%的育龄期夫妇受不孕不育问题影响,其中男方因素约占50%。男性不育症中,最常见的原因是精子发生障碍。研究发现遗传异常和环境因素都会影响精子发生,但大多数精子发生障碍患者的病因并不清楚。因此,探索男性不育的致病因素并揭示引起精子发生障碍的分子机制,对于不孕不育症的诊断和治疗具有重要意义。精子发生是一个动态、复杂的生物学过程,受到严密的调控。遗传因素是导致精子发生障碍的重要原因,寻找与精子发生障碍相关的基因并阐明其致病机制是不育症病因学研究的重点之一。近年来,大量研究表明DNA损伤修复基因在精子发生过程中发挥关键作用。作为经典的DNA交联损伤修复通路,范可尼贫血（Fanconi anemia,FA）通路由22个已鉴定的FA蛋白（FANCA-FANCW）和5种FA相关蛋白如FAAP24和FAAP100等组成。当DNA交联损伤发生后,FA核心复合体使FANCI-FANCD2二聚体单泛素化,并由FANCI-FANCD2二聚体招募下游蛋白进行修复。FA通路在精子发生中的重要作用被不断揭示,包括FANCA、FANCM和FANCU等FA基因突变会引起非梗阻性无精症（NOA）。此外,多种FA基因敲除雄鼠均表现为精子发生异常和生育障碍。目前认为,FANCA、FANCB和FANCD2等FA蛋白主要通过调控减数分裂中的甲基化修饰参与精子发生。FA通路活化的核心事件是FANCI-FANCD2二聚体单泛素化,然而,FANCI在精子发生中的作用及机制尚不明确。目的阐明FANCI在精子发生中的作用和机制,并进一步探索FANCI基因突变与NOA发病的关系。方法第一章中,通过CRISPR/Cas9技术构建Fanci-flag标签小鼠及Fanci敲除小鼠。通过对Fanci-flag小鼠的免疫荧光染色,揭示FANCI在精子发生中的表达和定位;通过对Fanci-/-小鼠的生殖系统表型及生育力观察,明确FANCI缺失对雄性生育力的影响;通过组织切片和HE染色,明确FANCI缺失对精子发生的影响;通过对Fanci-/-睾丸及精母细胞中相关标志物的染色,从未分化精原细胞维持、减数分裂DNA损伤应答事件和减数分裂表观修饰三个方面揭示FANCI在精子发生中的作用机制。第二章中,我们在NOA患者中进行FANCI基因筛查寻找可能的致病变异,并构建FANCI敲除HEK293T细胞系,分别在FANCI敲除细胞中过表达野生型及突变型FANCI。通过Western Blot及免疫荧光染色,比较野生型及突变型FANCI的表达及细胞内定位、DNA损伤后FA通路激活情况以及DNA损伤修复情况,明确突变对FANCI功能的影响。结果一.FANCI在小鼠精子发生中的作用和机制研究1.FANCI在精子发生过程中的表达和定位Fanci-flag小鼠睾丸免疫荧光染色结果显示,FANCI表达定位于精原细胞和精母细胞。此外,Fanci-flag睾丸染色体铺片的免疫荧光结果显示,FANCI从偶线期开始出现在染色体轴上并逐渐累积;到中粗线期后,常染色体轴上FANCI逐渐减弱;从早双线期开始,FANCI出现在性染色体上并逐渐累积,最终在晚粗线期时扩散到整个XY区域。该部分研究详细描绘了 FANCI在减数分裂中表达的时间和空间特点。2.FANCI在小鼠精子发生中的作用成年Fanci-/-小鼠睾丸显著减小,生育力丧失,进一步睾丸HE染色结果显示Fanci-/-小鼠精子发生障碍,具体表现为睾丸曲细精管中生精细胞大量丢失、细胞排布紊乱、附睾中没有精子。此外,Fanci-/-小鼠在12月龄时表现出比8周龄更严重的精子发生障碍表型。Fanci-/-小鼠睾丸DDX4和SOX9染色结果显示,Fanci敲除引起生殖细胞大量丢失而支持细胞未受明显影响。进一步TUNEL染色及凋亡标志物Cleaved-PARP1免疫荧光染色结果显示,Fanci-/-睾丸中凋亡细胞数量显著增加。通过Cleaved-PARP1与不同时期生精细胞的标志物SYCP3和PNA共染,明确了Fanci-/-小鼠睾丸中发生凋亡的细胞主要是初级精母细胞。Fanci-flag小鼠的睾丸免疫荧光染色结果显示,FANCI与FANCD2共同定位于初级精母细胞,进一步染色体铺片染色结果显示FANCI与FANCD2共同定位于性染色体上。此外,Fanci敲除后,睾丸中FANCD2表达显著下降并且FANCD2的焦点消失,说明了Fanci-/-小鼠睾丸中FA通路失活。3.Fanci基因敲除影响精子发生的机制通过PLZF免疫组化染色,发现Fanci-/-小鼠睾丸中未分化精原细胞显著减少,并且在12月龄时数量下降更为显著,说明Fanci敲除损害未分化精原细胞的维持,进而影响了持续的精子发生。对于减数分裂中发生的关键事件,免疫荧光染色的结果显示Fanci-/-精母细胞中联会标志物SYCP1没有明显改变。此外,γ-H2AX、RAD51及MLH1的染色结果也显示Fanci-/-小鼠减数分裂中关键的DNA损伤修复事件未受影响。为了明确减数分裂中的表观遗传修饰改变,进行免疫荧光染色并统计组蛋白甲基化H3K4me2、H3K9me2和H3K9me3在常染色体及性染色体上的荧光强度,结果显示Fanci-/-精母细胞性染色体上H3K9me3信号显著增强,H3K4me2强度显著降低,而H3K9me2信号无明显改变,揭示了Fanci敲除损害了减数分裂中性染色体的组蛋白甲基化修饰。二.FANCI基因突变在NOA发生中的作用研究1.NOA患者中发现FANCI纯合突变p.E96K在224例NOA患者中发现1例FANCI纯合突变c.G286A（p.E96K）,该突变位于FANCI-FANCD2互相作用的结构域,突变位点高度保守,生物信息学预测提示其可能为有害变异。2.突变型FANCI蛋白的功能研究丝裂霉素（MMC）诱导DNA交联损伤后,与过表达野生型FANCI的细胞相比,过表达突变型FANCI的细胞中FANCD2的泛素化水平及FANCD2核内焦点数量未受影响,提示突变不影响FA通路活化。同时,过表达突变型FANCI后,细胞在MMC处理后的γ-H2AX水平与野生型相比无明显差异,提示该突变对FA通路激活以及FANCI DNA损伤修复功能无明显影响。结论Fanci敲除小鼠减数分裂性染色体表观遗传修饰异常,造成初级精母细胞大量凋亡,最终导致精子发生障碍和不育,进一步证实了 FA通路在精子发生中发挥重要作用。此外,在NOA患者发现的FANCI纯合突变p.E96K对FANCI功能无显著影响,该基因突变在NOA发生中的作用有待进一步研究。