叶酸属B族维生素一员,是细胞分裂和维持细胞活性的重要组分,具有辅助转运一碳单位的功能。叶酸缺乏是诱发巨幼红细胞贫血、神经管畸形、先天性心脏缺陷和某些心血管疾病的重要危险因素。因此建立快速、便捷、准确的叶酸水平检测方法,对于提高全民健康水平、开展优生优育以及叶酸强化产品的市场监管,均有着重要的意义。本课题通过碳二亚胺法,将叶酸和牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白分别偶联合成了叶酸免疫原(FA-BSA、FA-BSA-ACA)和包被原(FA-OVA),蛋白浓度分别为12.59 mg/mL、10.8 mg/mL、9.71mg/mL。经紫外扫描进行了效果鉴定,并利用OPA法测得偶联比分别为13.16:1、8.90:1和4.22:1。使用FA-BSA与佐剂乳化后皮下注射的方法免疫小鼠,四次免疫后测定效价为1:60000,间接竞争试验的IC50为0.695μg/mL;抗体效价和性能均优于FA-BSA-ACA的免疫结果。因此取FA-BSA免疫后的小鼠脾细胞与培养的SP2/0细胞进行融合试验,融合后7天获得了能够生长的杂交瘤细胞,两周后进行ELISA试验检测上清,共有60孔阳性。将阳性孔内细胞进行有限稀释,最终检测上清无明显变化,考虑可能为杂交瘤细胞分泌抗体功能丢失。利用FA-BSA免疫家兔制备多克隆抗体,家兔血清效价为1:128000,间接竞争试验的IC50为59.91μg/mL。采用亲和层析纯化兔血清中抗叶酸的多克隆抗体,经BCA法定量蛋白浓度为0.63mg/mL,并在此基础上使用棋盘法确认最适抗原抗体工作条件,包被浓度为2 μg/mL,多抗浓度为1.27μg/mL,二抗最适稀释度为1:2000。在纯化抗体的基础上建立叶酸间接ELISA检测方法并制作标准曲线,其方程为Y=-0.4924X+0.3819,R2 值为 0.993,IC50 为 5.965 μg/mL。回收率在 83.333%-98.627%之间,批内变异系数在5.677%-8.553%之间,批间变异系数在5.217%-9.392%之间,对比未纯化的抗体检测效果有明显提高。