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1990年美国学者Babbs CF提出了大肠癌发生的自由基理论，其基本论点为：在肠道内经过一系列反应而生成的自由基激发不饱和脂质和食物前致癌物等的氧化链反应，使之成为有活性的致癌物和肿瘤促进剂，导致肠粘膜上皮细胞增生或肿瘤形成。因此，线粒体抗氧化力、膜电位和mtDNA变化在大肠癌发生、发展中的作用，近年来重新成为医学界研究的热点之一。 线粒体是细胞供能的主要场所，在生成ATP的同时伴有活性氧(即氧自由基)的生成。正常情况下，这些自由电子可以迅速被氧化酶系所破坏。但某些情况下，体内的氧化酶活性下降，所产生的氧离子不能迅速被清除，氧自由基产生则可影响线粒体的呼吸功能，继而使mtDNA受到损伤。 目前已知生物体内的抗氧化酶主要包括SOD、CAT和GSH-P_x等，它们可分别作用于自由基链锁反应的不同环节，在体内担负着清除自由基的重要任务；丙二醛(MDA)是脂质过氧化产物，常作为脂质过氧化反应的测定参数。上述指标可以综合反映机体的氧化与抗氧化的平衡作用。 细胞内氧化磷酸化、能量代谢和ROS作用都依赖于线粒体的正常功能。由于线粒体膜上各种生物泵的作用，使线粒体膜内外维持着不同梯度的离子浓度，产生线粒体膜电位。线粒体膜电位是观察线粒体膜通透性，评价线粒体功能的敏感指标。 8-OH-dG是目前被公认的DNA氧化性损伤标志，其数量和细胞DNA受到氧化损伤程度呈正相关。8-OH-dG可以改变碱基配对的性质，导致难以修复的DNA的GC和TA的易位，从而引起DNA分子的突变而致癌。因此通过检测8一OH一dG可以间接评价ROS对DNA的损伤作用，是分析致癌因素和致癌机理的重要手段。 人类mtDNA为全长16596bP的双股闭环分子，包含13个氧化磷酸化多肤编码基因，22个tRNA基因和2个rRNA基因。这些基因之间排列紧凑，除mtDNA的D环(DISplacement一loop)的一小段区域外，其它序列无内含子，部分区域还出现重叠，因此任何mtDNA的突变都会影响到其基因组内的一个重要功能区域。由于mtDNA处在氧自由基活动最频繁的部位，且缺乏组蛋白的保护和有效的修复系统等原因，更易受线粒体膜内侧所产生的自由基的损害。越来越多的资料表明，mtDNA可以稳定地整合到核基因组中〔〕，肿瘤细胞核基因组中存在着mtDNA整合的现象。mtDNA损伤后形成游离的mtDNA或mtDNA片段，其可能与致瘤病毒一样，穿过核孔，随机整合到核基因组中。整合的结果，即可能导致染色体DNA不稳，癌基因激活和/或抑癌基因失活，从而使细胞增殖和分化异常，导致细胞癌变 本研究以人大肠癌组织的线粒体作为研究对象，观察线粒体的氧化性损伤和mtDNA突变，探讨其在大肠癌发生、发展中的作用。主要研究内容如下: 1.用比色法检测自由基清除酶谱SOD、CAT、GSH一Px的活性和脂 质过氧化水平MDA的含量，探讨大肠癌线粒体的抗氧化力作 用; 2.以罗丹明123(Rhodaminel23，Rh123)作为荧光标记物，采用 流式细胞术(Flow CytoMeter，FCM)，检测线粒体膜电位的水 平，探讨以线粒体作为抗癌药物靶点的机制。 3.用高效液相色谱仪一电化学检测法检测mtDNA和nDNA中 8一OH一dG的含量，探讨DNA的氧化损伤在大肠癌发生中的 可能作用。 4.自行设计mtDNA扩增引物，对PCR产物直接测序，检测大肠 癌组织mtDNA突变情况，寻找大肠癌的mtDNA特异性突变 实验结果如下: 一6· 大肠癌组织线粒体自由基清除酶谱SOD、CAT及GSH一Px活性(分别为8.93士0.59，l一58士7.48，34.35士6.88ntnol/g.ww)较正常粘膜(分别9.79士0.75，15一2士6.92，43.34士4.24nmol/g.ww)明显降低，差异显著，分别为P<0.01，0.01<P<0.05，P<0.01;大肠癌组织中MDA含量为123.08士70.73 nlnol/g.w’w，正常粘膜中MDA含量为65.87士18.63 nlnol/g，ww，大肠癌组织中MDA显著降低，差异具有显著性P<0.01。说明线粒体抗氧化体系受到严重损伤，提示人类大肠癌线粒体损伤和大肠癌发生有密切关系，对于SOD、CAT、GSH一Px和MDA的检测有助于临床大肠癌的诊断。 大肠癌组织中线粒体的平均荧光强度为9.84士1 .23，正常粘膜中线粒体平均荧光强度为5.38士2，01，检测结果显示大肠癌线粒体膜电位比配对正常肠粘膜显著增高，差异具有显著性P<0.01。大肠癌组织的线粒体膜电位比配对正常肠粘膜显著增高，说明大肠癌组织线粒体膜的负电荷比正常肠粘膜组织显著增加。这种线粒体极性的显著差异，提示我们阳离子亲脂药物会优先在癌细胞的线粒体中蓄积并产生毒性作用，进而破坏线粒体结构，最终杀伤肿瘤细胞。因此，可以认为线粒体是潜在的抗癌药物的选择性靶点。 大肠癌组织mtDNA中、nDNA中和总DNA中8一OH一dG含量分别为44 1 .87士39.16、129.57士22.71和571.44士50.68，正常对照组织mtDNA中、nDNA中和总DNA中8一OH一dG含量分别为42.64士11 .51、17.39士4‘21和60.03士10.38，检钡(结果显示大肠癌?