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临床输血是多种疾病治疗的重要手段。然而,天然血液具有来源匮乏、应用前需要进行血型匹配以防止交叉感染等弊端,使得诸多学者开始进行红细胞代用品的研究。本文旨在借助化学修饰方法调控成人血红蛋白(Human adult hemoglobin,HbA)的氧亲和力以获得一种低氧亲和力、高四聚体稳定性和高自氧化速率的三重修饰血红蛋白氧载体。本课题以HbA作为研究对象,利用分子内交联、还原烷基化以及琥珀酰亚胺化学反应对其进行化学修饰,并研究修饰前后HbA及其衍生物相关的结构和功能特征。研究内容主要分为两个部分:首先,利用双(3,5-二溴水杨酸基)延胡索酸酯(Bis(3,5-dibromosalicylate)fumurate,DBBF)对血红蛋白分子进行分子内交联,提高游离血红蛋白的四聚体稳定性,使之具备类似于红细胞内的四聚体结构形式从而降低氧亲和力;在此基础上再利用乙醛酸钠对其进行末端羧甲基化反应,凭借静电排斥作用维持其低氧亲和力的T态,得到三种小分子修饰产物(αα-Hb、Glx-Hb以及Glx-αα-Hb)并探究了修饰前后血红蛋白分子的结构和功能性质等变化情况。随后,利用带有八臂琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)对HbA及其衍生物进行共价修饰得到四种PEG化血红蛋白分子(PEG-Hb、PEG-αα-Hb、PEG-Glx-Hb 以及 PEG-Glx-αα-Hb),以进一步提高其四聚体的稳定性,并增加其流体力学体积,以降低因血管外溢而引发的肾毒性同时也可以降低免疫原性。根据研究结果发现,双重修饰产物(Glx-αα-Hb)的P50值为34.6 mmHg,约为原蛋白的3倍,氧转运效率(Oxygen transfer efficient,OTE)则由原蛋白的9.1%增加到 33.1%;三重修饰产物(PEG-Glx-αα-Hb)的 P50和 OTE较 Glx-αα-Hb有轻微的降低,其中P50为27.8 mmHg且OTE为30.5%。同时伴随着自氧化速率的增加和高铁血红蛋白(metHb)含量的增大,值得指出的是化学修饰程度越高对应的自氧化速率和metHb含量越大。其中,Glx-αα-Hb的自氧化速率和metHb含量分别为 0.036 h-1 和 12%(4 小时),而 PEG-Glx-αα-Hb 则为 0.044 h-1 和 15%。圆二色光谱远紫外区域(260～190 nm)的结果表明化学修饰并未对HbA二级结构没有产生影响,但近紫外区域(480～260nm)的结果表明双重修饰和三重修饰均影响了对血红蛋白的四级结构和血红素的微环境。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,发生分子内交联反应后的修饰产物在32 kDa附近具有明显条带,这是由于分子内交联反应使得HbA的两个Lys-99(α)残基之间形成了富马酰亚胺桥的共价连接;经八臂PEG修饰后HbA的相对分子质量主要集中在90 kDa及以上区域,可见PEG化共价修饰能明显增加血红蛋白的相对分子质量。分子排阻层析法分析结果表明,经PEG修饰后血红蛋白的出峰位置较其所对应的原蛋白向左移动其流体力学体积明显增大,此结果也在一定程度上说明其与稳定性增强有关;拉曼光谱学图谱结果表明,双修饰产物在1340～1390 cm-1范围内拉曼强度明显增加,这与其四级结构的改变存在着联系。借助胰蛋白酶肽图谱和高效液相色谱确定双重化学修饰反应发生的位点是Val-1(α)和Lys-99(α)。根据紫外分光光度法动力学可知包括原蛋白在内的八种化学修饰产物中巯基数量并未发生改变,但不同的修饰方法对巯基反应活性的影响存在一定差异,主要是由于化学修饰对HbA的αlβ2界面造成了扰动。基于分子内交联、还原烷基化以及琥珀酰亚胺化学反应修饰得到的三重修饰血红蛋白氧载体具有较低的氧亲和力能够有效地向缺氧组织释放氧气同时伴随着自氧化速率的增加和metHb的产生;由于富马酰亚胺桥的形成以及八臂PEG的修饰增强了亚基间的相互作用使得HbA的四聚体稳定性提高。