研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)是指冠状动脉粥样硬化使冠脉血管腔狭窄或阻塞,导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的疾病,是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型,发病率在我国呈逐年攀升趋势,是严重危害人类健康的常见病。本病由多种原因综合所致,与年龄、性别、血压、血脂、血糖、遗传等多种因素相关,因此,本病病因及发病机制成为近几十年来医学研究的热点。早期研究中,人们发现动脉血管内膜形成粥样斑块是冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的主要发病原因,病变特征是血中脂质在动脉内膜沉积,引起内膜局灶性纤维性增厚及其深部成分的坏死、崩解,形成粥样物,所以早期研究者认为动脉粥样硬化是因脂质沉淀于血管内皮所致,即传统的脂质沉淀理论。血脂增高被认为是冠心病的重要高危因素,但统计发现仅有约50%的冠心病患者表现为血脂增高。进一步研究表明,动脉粥样硬化不仅是一种单纯的脂肪沉积疾病,机体的慢性炎症机制在粥样硬化斑块的形成及发展中起着关键作用。上世纪九十年代Dr.Russell Ross首次提出了“损伤反应”理论,认为动脉粥样硬化是多种损伤因素导致的发生在血管内膜的慢性炎症反应,该理论使得人们对于动脉粥样硬化机制的认识有了质的提高。Dr.Russell Ross认为,动脉粥样硬化早期斑块形成始于一系列机械学和生化学刺激引起的功能性或者形态学内皮损伤,细胞粘附分子表达增加,合成细胞因子如白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)等,单核及巨噬细胞随后被激活并聚集在动脉壁,接下来,脂肪积聚、生长因子和细胞因子进一步释放以及平滑肌细胞和淋巴细胞激活增生。伴随着这些过程的继续,粥样斑块逐渐成长和成熟。当富含脂肪的细胞死亡,便形成斑块的核心部分,导致斑块重构和纤维化或者最终破裂,血小板在内皮细胞破损处聚集,形成血栓,常常导致急性冠脉综合征。总之,巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、血小板以及这些细胞释放的各种因子(如细胞素、生长因子、肿瘤坏死因子和氧自由基等)介导的炎症反应机制参与了动脉粥样硬化的发生,促进了AS的发展、恶化。炎症反应在动脉粥样硬化过程中起到了关键作用,并与疾病预后有关。研究证实,动脉粥样斑块内炎症反应非常活跃,有大量的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T淋巴细胞等炎症细胞浸润,活动性炎症反应亦可促使稳定性粥样斑块转变为不稳定性斑块,这是冠状动脉内急性血栓形成的诱因。因此我们认为,阻断血管内皮的炎症反应或许可以成为冠状动脉粥样硬化性疾病的预防和治疗途径。程序性死亡因子配体1(programmed cell death ligand1, PD-L1、B7-H1或CD274)是由290个氨基酸构成的Ⅰ型跨膜蛋白。最初因为被发现在肿瘤细胞中高表达,人们推测其与肿瘤细胞浸润有关,但随着研究的深入,发现除肿瘤细胞以外,PD-L1在多种组织细胞和炎症细胞上均有表达,如血管内皮细胞、Kupffer细胞、星形细胞、树突状细胞、骨髓源性肥大细胞、胎盘合体滋养层细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等；PD-L1的功能除与肿瘤细胞浸润相关以外,也与多种病理过程有着密切的关系,如移植免疫反应、自身免疫性疾病、微生物感染等。近年来多项研究认为,PD-L1作为B7家族分子的成员,其受体为程序性死亡因子1(programmed cell death1receptor, PD-1或CD279)=PD-1的胞浆区尾部有2个酪氨酸残基,N端酪氨酸残基参与构成一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif, ITIM), C端酪氨酸残基则参与构成一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM),其中ITSM高度保守,提示其具有重要功能。研究表明,当PD-1与其配体结合时,ITSM发生磷酸化,通过一系列的生化过程使下游的效应分子去磷酸化,发挥负性调节作用。PD-L1是PD-1的配体之一,与PD-1结合后发挥免疫调控作用。相关研究表明,PD-1/PD-L1信号系统对免疫机能的调节作用,与动脉粥样硬化的慢性炎症机制同样相关。Gotsman等研究冠状动脉斑块时,发现用荧光免疫技术可以探测到PD-L1表达于多处动脉粥样斑块内。从PD-L1、PD-L2、LDL受体三种基因均敲除(triple knockout, TKO)小鼠体内分离的APC能更强的刺激T细胞对ox-LDL的炎症反应,与LDL受体敲除的小鼠相比,TKO小鼠主动脉弓、降主动脉的AS损伤区域增加了3倍。Lee等研究者发现冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-1表型及树突状细胞PD-L1表型均较健康人的明显降低。本课题组的前期研究表明,稳定性心绞痛及急性冠脉综合症患者外周血T淋巴细咆PD-L1蛋白表达均较正常对照组明显增加,由此推测PD-L1可能在动脉粥样硬化斑块形成过程中发挥了重要作用。目前为止,细胞表达PD-L1蛋白以及PD-L1蛋白发挥免疫调控作用的完整机制仍未完全清晰,不同研究对象及使用不同刺激物,得出结果不尽相同,归纳起来,影响PD-L1表达的细胞信号通路可能为JAK/STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路、MEK/Erk信号通路、NPM/ALK通路、MAPK通路等,并且与IRF-1和STAT-3转录因子有关。p38MAPK信号通路是MAPK通路的重要分支,它通过使转录因子磷酸化而改变基因的表达,参与多种细胞内信息传递过程,能对广泛的细胞外信号发生反应,介导细胞生长、发育、分化及死亡的全过程。本课题组前期研究结果表明,p38MAPK通路参与了树突状细胞分化表达PD-L1蛋白的调控过程,但是对于动脉粥样硬化过程启动并发展至关重要的血管内皮细胞,尚无相关研究。鉴于此,本课题以体外培养脐静脉内皮细胞为研究对象,利用炎症因子TNF-a刺激模拟炎症过程,观察脐静脉内皮细胞表达PD-L1的变化,首先明确TNF-a对脐静脉内皮细胞PD-L1蛋白表达的影响；再以p38蛋白特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK通路,重复TNF-a刺激,观察脐静脉内皮细胞表达PD-L1与p38MAPK信号通路的关系,探讨TNF-a诱导脐静脉内皮细胞表达PD-L1蛋白的细胞分子机制,研究负性协同刺激信号系统(PD-1/PD-L)调控慢性炎症过程的机理,为动脉粥样硬化的免疫机制研究提供理论基础。第一部分TNF-α刺激导致脐静脉内皮细胞存活率下降目的观察不同浓度的TNF-α对脐静脉内皮细胞活性的影响,筛选出对脐静脉内皮细胞有效且组间有统计学差异的TNF-α浓度梯度。对象和方法1.对象体外培养的健康人脐静脉内皮细胞(HUVECs)2.方法2.1脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定无菌条件下取新生儿脐带约25厘米(中山大学第一附属医院提供,产妇知情同意,过程符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准),剪去两端夹痕,挤出脐带内残留血液,PBS反复冲洗至冲洗液无色。夹紧血管下端,从上端注入0.1%胶原酶Ⅰ与含EDTA的胰蛋白酶(0.125%)消化获取脐静脉内皮细胞,PBS离心冲洗两遍洗去胰蛋白酶,用脐静脉内皮细胞专用培养基将细胞接种于25cm2细胞培养瓶,置于恒温培养箱中(37℃,5%C02)培养,每12小时显微镜下观察细胞形态及贴壁状况,每48小时全量换培养基。约72小时后细胞铺满培养瓶底,单层均匀排布,呈典型铺路石样。弃去培养基,PBS冲洗,胰蛋白酶消化,收获细胞并传代培养。试验所用细胞为第3-5代,内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原荧光染色。脐静脉内皮细胞专用培养基成分(每100ml培养基含：FBS20ml(20%)from Gibicol;Beta-ECGF5ng/ml from sigma；L-glutamine,1mM；Penicillin-Streptomycin；heparin2500U/100ml;M-19980ml from Gibicol。)2.2脐静脉内皮细胞冻存备用至第3代细胞培养至对数生长期,弃去上层培养基,贴壁的脐静脉内皮细胞用无Ca2+、Mg2+的PBS轻柔冲洗2次以除去培养基成分,在每个培养瓶中加入含EDTA的浓度为0.125%胰蛋白酶消化细胞,显微镜下观察,待细胞由梭形回缩至球形时加入血清终止消化,PBS再次冲洗两遍,加入成分为20%FBS、10ng/mLβ-ECGF、25U/mL肝素的M199培养基3ml,反复吹打至脐静脉内皮细胞脱离瓶壁悬浮于培养基中,调整细胞浓度至105个/ml,吸取3ml用于细胞鉴定及Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞活性检测试验,其余细胞经1000转/min、5min离心后,弃去上层培养基,加冻存液冻存于液氮中备用。冻存液配制：85%M199培养基、10%胎牛血清、5%DMSO。2.3分组及CCK-8细胞活性检测实验将浓度为105个/ml的脐静脉内皮细胞(第3代)置于25cm2细胞培养瓶中培养,按照1：3传至第4代,至对数生长期,弃去培养基,PBS冲洗、胰蛋白酶消化、吹打收集细胞,加入HUVECs专用培养基重悬,再次调整浓度为105个/ml。按照8组、每组5复孔接种于96孔培养板中,每孔100μl,编号为1,2,3,4,5,6,7,8组。另设一本底组编号为0,只加100μl全培养基,不含脐静脉内皮细胞,用于检测CCK-8实验本底值。共9组,45复孔。为减少试剂蒸发所致误差,96孔板边缘培养孔弃用并加PBS溶液填充。完毕后,将96孔板置于培养箱中预培养24h,预培养后加入HUVECs专用培养基、含TNF-α浓度为2μg/ml的培养基,调整每孔总容量至200μl。其中,1—8组含肿瘤坏死因子浓度分别为Ong/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml,60ng/ml,80ng/ml,100ng/ml,0组加专用培养基至200μL,不含脐静脉内皮细胞及肿瘤坏死因子。继续培养(37℃,5%CO2)48小时后加入Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞活力检测试剂,每孔10μl,恒温培养箱中反应4小时后酶标仪下检测450nm波长处的吸光度值(OD值)。3.统计学方法所有数据采用SPSS13.0软件处理,计量数据以均数±标准差(x±S)表示,统计学分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD-t法,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.脐静脉内皮细胞形态学观察显微镜下观察,原代脐静脉内皮细胞呈单层生长,形态为卵圆形,边界清楚,细胞质丰富,胞核呈椭圆形。培养2-3天后细胞铺满板底,呈梭形,边界清楚,细胞质丰富,胞核呈椭圆形,单层排列,分布均匀,贴壁生长,呈典型铺路石样。2. Ⅷ因子相关抗原荧光染色荧光显微镜下观察,细胞质内可见棕黄色颗粒,胞核为蓝色,说明细胞内有内皮细胞特有的第Ⅷ因子相关抗原存在,对照组为阴性反应。3. CCK-8细胞活性检测结果从组1到组7,随TNF-α浓度逐渐升高,各组细胞在450nm波长下的吸光度值(OD value)逐渐降低(P<0.05),从(0.721±0.0129)降至(0.548±0.0196),组间差异具有统计学意义。但组7与组8之间差异无统计学意义(P>0.05),我们认为可能与浓度梯度过小有关。结论1.肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激对脐静脉内皮细胞活性可产生明显影响,5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的组间差异具有统计学意义,80ng/ml、100ng/ml组间差异不具统计学意义。2.拟选取0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、80ng/ml浓度分组进行下一步实验。第二部分TNF-α对脐静脉内皮细胞分化表达PD-L1蛋白的影响目的：采用不同浓度TNF-α持续刺激脐静脉内皮细胞,Western Blot方法检测各组细胞PD-L1蛋白表达。探讨TNF-α对脐静脉内皮细胞分化表达PD-L1蛋白的影响。对象和方法1.对象体外培养脐静脉内皮细胞。2.方法2.1脐静脉内皮细胞解冻培养。将冻存于液氮中的脐静脉内皮细胞(3代)取出,迅速置于37℃恒温水浴锅中,约1-2分钟后完全融化,将含有细胞的冻存液移至离心管中,经1000转／分、5分钟离心,吸去上层冻存液,加入HUVECs专用培养基,反复混合均匀,移入25cm2细胞培养瓶中。每12小时观察细胞形态,每48小时全量换液。待细胞培养至对数生长期,按照1：4传代。2.2实验分组及肿瘤坏死因子干预。待4代细胞培养至对数生长期,换液加入含有肿瘤坏死因子的专用培养基,调整肿瘤坏死因子浓度分别为A组Ong/ml、B组5ng/ml、C组20ng/ml、D组80ng/ml。恒温培养箱中孵育48小时,弃去上层培养基,PBS反复冲洗2遍,含EDTA的胰蛋白酶消化,加入PBS溶液反复吹打细胞至脱落悬浮,离心收获各组细胞,PBS反复离心冲洗2遍,加入裂解液提取蛋白,BCA法总蛋白定量。调整上样量为25μg总蛋白／样本,上样,电泳,转膜,封闭过夜。封闭完毕后PBST洗膜5次,加一抗,37℃反应1.5h, PBS洗膜5次,加辣根过氧化物酶标记二抗,37℃反应1h, PBS洗膜5次。染色,曝光,采用BIORAD GELDOC XR凝胶成像系统依次显影、定影,QuantityOne Basic软件分析胶片中蛋白条带。本步试验重复3次。3.统计学方法所有数据均采用SPSS13.0软件处理,计量数据以均数±标准差(x±S)表示,统计学分析多样本比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD-t法,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果1.解冻后细胞生长状态正常,贴壁生长,呈梭形,单层排布,呈典型铺路石样。细胞质丰富,胞核呈椭圆形。2.随TNF-a浓度逐渐升高,A、B、C、D四组细胞的PD-L1蛋白表达逐渐下降(P<0.05),Western blot曝光显色灰度比值分别为A组(1.797±0.1550),B组(1.512±0.1022),C组(1.108±0.0799),D组(0.845±0.0542),组间差异具有统计学意义。结论肿瘤坏死因子α可明显抑制脐静脉内皮细胞分化表达PD-L1蛋白。抑制强度与TNF-a浓度正相关。第三部分TNF-a通过p38MAPK通路调控脐静脉内皮细胞表达PD-L1目的以p38蛋白特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号通路后,观察脐静脉内皮细胞受TNF-α刺激后PD-L1表达变化,探讨脐静脉内皮细胞表达PD-L1与p38MAPK信号通路的关系。对象和方法1.对象体外培养人脐静脉内皮细胞。2.方法2.1脐静脉内皮细胞解冻和培养。将冻存于液氮中的脐静脉内皮细胞(3代)取出,迅速置于37℃恒温水浴锅中,约1-2分钟后全部融化,将含有细胞的冻存液移至离心管中,经1000转/分、5分钟离心,弃去上层冻存液,加入HUVECs专用培养基,反复混合均匀,种植于25cm2细胞培养瓶中。每12小时观察细胞形态,每48小时全量换液。待细胞培养至对数生长期,按照1：3传至第4代。2.2实验分组将第4代脐静脉内皮细胞接种于6孔培养板中,设3组,每组2复孔。根据是否使用TNF-α和p38MAPK通路抑制剂SB203580将实验分成三组,TNF-α浓度选择80ng/ml, SB203580用二甲基亚砜(DMSO)溶解。第一组为正常培养组：使用专用培养基孵育脐静脉内皮细胞48小时作为空白对照；第二组为TNF-α干预组：使用专用培养基和配制好的含TNF-α浓度为2μg/ml的培养基,调整TNF-α浓度为80ng/ml,温箱中培养48小时；第三组为TNF-α(?)SB203580共同干预组：加入DMSO溶解的p38MAPK阻断剂SB203580预处理1小时,然后加入含TNF-α的培养基,调整TNF-α浓度为80ng/ml,置于温箱中培养48小时。2.3Western blot方法检测PD-L1蛋白收获各组细胞,加入裂解液提取蛋白,BCA法总蛋白定量。调整上样量为25μg总蛋白／样本,上样,电泳,转膜,封闭过夜。封闭完毕后PBST洗膜5次,加一抗,37℃反应1.5h, PBS洗膜5次,加辣根过氧化物酶标记二抗,37℃反应1h, PBS洗膜5次。染色,曝光,采用BIORAD GELDOC XR凝胶成像系统依次显影、定影,QuantityOne Basic软件分析胶片中蛋白条带。本步实验重复3次。3.统计学方法所有数据采用SPSS13.0软件处理,计量数据以均数±标准差(x±S)表示,统计学分析多样本比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD-t法,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1. TNF-α干预组较正常培养组、TNF-α和SB203580共同干预组表达PD-L1明显下降,依次分别为(0.486±0.0571)、(1.069±0.0401)、(1.215±0.0506),P<0.05,组间差异具有统计学意义。正常培养组、TNF-α和SB203580共同干预组表达PD-L1差异亦有统计学差异,正常培养组低于TNF-α和SB203580共同干预组。结论1. p38MAPK通路参与了TNF-α影响脐静脉内皮细胞分化表达PD-L1蛋白的过程。2.正常培养组PD-L1蛋白表达低于TNF-α和SB203580共同干预组,我们考虑可能是因为存在部分内源性TNF-α或者其他细胞因子通过p38MAPK通路调控PD-L1蛋白表达。