光调控荔枝果皮花色苷生物合成的分子机制初探

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荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是无患子科荔枝属的常绿乔木,为我国南亚热带重要栽培果树。果实色泽是荔枝果实品质的重要组成部分,通过类黄酮途径合成的花色苷是决定荔枝果实着色的主要色素,而光是影响荔枝果皮着色和花色苷生物合成的关键因素之一。对光调控荔枝果皮花色苷生物合成的分子机理的探究,能为荔枝果实色泽调控及外观品质的改良提供理论依据,并且对提高荔枝的商品价值具有实践意义。本论文以品种优良、着色良好且具代表性的荔枝品种‘桂味’为试材,利用RT-PCR、酵母双杂、双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)、瞬时表达、双荧光报告和酵母单杂等技术手段,对套袋和摘袋处理后果皮花色苷含量及主要酶基因进行分析,并筛选和克隆关键光受体基因LcUVR8和关键光调控因子LcCOP1与LcHY5,对其进行序列分析及互作分析,以及关键光调控因子LcHY5对结构基因启动子的激活能力测定,探讨了光调控荔枝果皮中花色苷生物合成的初步调控网络。主要研究结果如下:1、遮光能够明显抑制‘桂味’荔枝果皮花色苷的积累,一直套袋的果实呈现浅黄色但能够正常成熟。摘袋后,花色苷迅速合成,但成熟时花色苷含量仍低于对照。2、Real-Time PCR分析套袋、摘袋处理后及对照的果皮花色苷生物合成途径中8个重要结构基因表达情况,发现遮光处理显著抑制了LcPAL、LcCHI、LcCHS、LcF3H、LcF3’H、LcDFR、LcANS和LcUFGT的正常表达;解除遮光后结构基因的表达量均有不同程度的增加,其中LcPAL、LcCHI、LcCHS、LcF3H、LcDFR和LcANS在摘袋后12 h达到表达高峰,LcF3’H和LcUFGT的表达与花色苷含量的变化规律基本一致。3、Real-Time PCR分析在解除遮光后光受体及光信号调控基因的表达情况,筛选出与光调控荔枝果皮花色苷生物合成相关的基因LcHY5、LcCOP1、LcCOP10和LcUVR8,克隆其全长,长度分别为504 bp、1920 bp、519 bp、1437 bp,编码的氨基酸数目分别为167、639、172、478个。4、通过酵母双杂系统和BiFC系统,证明LcUVR8、LcHY5、LcMYB1与LcCOP1之间存在相互作用,而与LcCOP10之间不能互作。5、通过根癌农杆菌介导转化系统证实LcCOP1能够与拟南芥cop1-4突变体实现功能互补,负调控花色苷的生物合成,恢复突变体下胚轴的伸长;通过转LcMYB1+bHLH3基因K326烟草叶片瞬时表达系统,证实LcCOP1可以抑制花色苷生物合成结构基因的表达,抑制转LcMYB1+bHLH3基因烟草叶片中花色苷的积累。6、通过对花色苷生物合成途径中重要结构基因启动子区域的元件分析,发现LcPAL、LcCHS、LcCHI、LcF3H、LcDFR和LcANS的启动子区域内具有LcHY5的结合元件G-box,并以‘桂味’荔枝基因组DNA为模板,将目标结构基因启动子区域克隆了出来。7、利用酵母单杂系统和双荧光报告系统,证实LcHY5可以激活花色苷生物合成途径中结构基因LcCHS、LcCHI、LcF3H和LcANS启动子的活性。
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