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马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种重要的免疫抑制与快速发作的T淋巴细胞肿瘤病。MicroRNA(miRNA)是一类长度介于19~24 nt的非编码小分子RNA,可通过种子序列5’末端的2~7位核苷酸与靶基因mRNA的3’-UTR碱基配对结合抑制其表达。MDV基因组编码大量病毒miRNA,MDV-1共编码14个miRNA前体,表达26个成熟体miRNA。它们可能在MDV致病过程中的病毒复制、潜伏感染及肿瘤发生中起重要作用。此前对这些病毒miRNA的体内动态表达谱分析发现,miR-M11-5p与MDV-1致病及致瘤的进程密切相关。在对Mid基因簇各个miRNA进行基因缺失的病毒致病性试验表明,与亲本毒株GX0101相比较,miR-M11-5p基因缺失毒株的致瘤率明显升高,预示miR-M11-5p在MDV致瘤过程中可能作为肿瘤抑制因子发挥抑癌作用。为了进一步揭示miR-M11-5p在MDV肿瘤发生发展中的调控机制,本研究利用鸡胚成纤维细胞(CEF)总RNA的cDNA为模板,通过hybrid-PCR扩增miR-M11-5p的候选宿主靶基因片段,然后连接至pMD19-T载体、转化至E.coli JM109中构建cDNA文库。对文库菌落进行PCR鉴定、测序分析以及Blast序列对比,共获得77个候选宿主靶基因,其中37个miRNA结合靶点位于候选靶基因的3’-UTR中。构建含有3’-UTR的候选靶基因结合位点的psiCHECK-2重组载体,与miR-M11-5p mimics重组质粒共转染HEK 293T细胞,进行双荧光素酶报告试验分析。结果显示,候选靶基因MAFB(v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B)、LOC776816和RFX7(regulatory factor X7,调节因子X7)的psiCHECK-2-3’-UTR质粒荧光素酶报告活性均受到miR-M11-5p mimics的显著抑制。而后我们构建了psiCHECK-2-mut-MAFB-3’-UTR、psiCHECK-2-mutLOC776816-3’-UTR和psiCHECK-2-mut-RFX7-3’-UTR与mut-miR-M11-5p mimics共转染HEK 293T,结果显示突变后的miR-M11-5p失去抑制MAFB、LOC776816和RFX7这三个3’-UTR双荧光素酶报告基因的活性,而3’-UTR重组质粒突变后不受miR-M11-5p所抑制。在CEF细胞中过表达miR-M11-5p,通过RT-qPCR检测MAFB、LOC776816和RFX7的mRNA表达水平,结果显示miR-M11-5p可显著下调这3个候选靶基因mRNA的表达水平。上述结果证实MAFB、LOC776816和RFX7是miR-M11-5p的宿主靶基因,为进一步阐明miRM11-5p在MDV肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。