研究背景与研究目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生于老年和老年前期的一种常见的增龄性疾病,带来沉重的社会和经济负担。2019年全球用于痴呆的花费约1万亿美元。在我国,AD的患病情况及所造成的社会负担同样严峻,2015年我国有痴呆患者950万人,占全球的五分之一。目前为止,AD的病因及发病机制仍不明确,也没有针对AD的特效治疗方法。因此,进一步研究AD的病因及发病机制,对于探索防治AD的治疗方法有重要的意义,是亟需解决的重大问题。线粒体是真核细胞内能量转换和生物氧化功能的重要场所,线粒体参与细胞内稳态、细胞增殖、细胞衰老及死亡等多种生物学过程。线粒体的不对称分裂可以导致子代线粒体膜电位的减弱或消失,即线粒体的去极化;多种体内外刺激,如β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)寡聚体也可以造成线粒体的病理性去极化,这些去极化的线粒体可以通过线粒体融合进行再循环或通过自噬途径清除,即线粒体自噬(mitophagy)。PINK1/parkin途径是最经典的线粒体自噬途径。如果自噬功能降低,会导致受损的线粒体在细胞内聚积,线粒体功能障碍,导致神经退行性疾病。AD患者海马区神经元内正常线粒体数目明显减少,可见大量的嵴破坏的线粒体和线粒体碎片在胞浆内沉积,部分被脂褐素相关的囊泡包裹,提示线粒体自噬异常和线粒体功能障碍参与了 AD的发病过程。研究表明,AD中受损的线粒体自噬与溶酶体功能异常有关。转录因子EB(transcriptionfactor EB,TFEB)是近年来发现的一种与自噬密切相关的转录因子,在溶酶体正常功能中发挥着重要的作用,能够有效诱导溶酶体途径清除功能,对于维持自噬/线粒体自噬起着至关重要的作用。在APP/PS1转基因小鼠中过表达TFEB,能够有效减少淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的生成,降低可溶性Aβ水平及减少淀粉样斑块生成,减轻APP/PS1转基因小鼠智能损害,表明TFEB在AD中发挥保护作用。模式识别受体(pattern-recognitionreceptor,PRR)是固有免疫系统识别外来刺激及感受来自机体内部的损伤特异性蛋白。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide binding oligomerization domain like receptor,NLR)是一种定位于细胞内的模式识别受体,它能够直接或者通过凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD,ASC)募集半胱天冬蛋白酶前体pro-Caspase-1,形成一个蛋白质复合体,即炎症小体(inflammasome)。炎症小体的组装可以活化pro-Caspase-1,产生具有酶活性的Caspase-1;激活的Caspase-1继而对炎性细胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(interleukin-18,IL-18)的前体进行加工,使其成熟并分泌到细胞外,发挥促炎作用。NLRP3是目前研究最多的炎症小体,参与AD的发病。AD患者和APP/PS1转基因小鼠脑组织均存在NLRP3炎症小体的过度激活;应用NLRP3的抑制剂MCC950,可以促进APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ的清除,并改善动物的认知功能。线粒体与NLRP3炎症小体的活化有关。活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生、线粒体DNA的释放、NLRP3炎症小体向线粒体的转位、线粒体内膜上的心磷脂都可以激活NLRP3炎症小体,提示线粒体在NLRP3炎症小体介导的炎症过程中可能发挥着重要作用。有研究表明,线粒体自噬对NLRP3炎症小体的活化具有明显的负性调节作用。褪黑素可以通过改善线粒体功能拮抗APP/PS1转基因小鼠的病理损伤和认知功能下降。那么,线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白在APP/PS1转基因小鼠脑内是否存在增龄性动态改变?线粒体自噬能否通过调节NLRP3炎症小体和Caspase-1活性对APP/PS1转基因小鼠障碍产生影响,机制如何?褪黑素在AD中的保护机制是否与促进线粒体自噬、调节NLRP3炎症小体和Caspase-1活性有关?褪黑素对线粒体自噬的影响是否与TFEB功能有关?依据上述背景,本研究首先观察了 APP/PS1转基因小鼠模型脑内线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白随月龄增加的动态变化;在体外采用A β 25-35分别干预体外培养的SH-SY5Y细胞,观察线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白的变化,以及应用线粒体自噬促进剂、NLRP3炎性小体抑制剂预处理对上述指标的影响;在APP/PS1转基因小鼠模型中探索了褪黑素对于智能改善、脑内线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白等的影响;在上述细胞模型和动物模型中观察了褪黑素能否通过调控TFEB影响线粒体自噬。研究内容1.APP/PS1转基因小鼠模型脑内线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白随月龄动态变化研究。2.线粒体自噬通过调节NLRP3炎症小体减轻Aβ细胞毒性的机制。3.褪黑素通过促进APP/PS1转基因小鼠脑内细胞线粒体自噬改善动物认知功能的机制研究。4.褪黑素调控TFEB入核促进线粒体自噬在AD中的保护机制研究。研究方法1.APP/PS1转基因小鼠模型脑内线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白随月龄增加的动态变化研究。选取以C57/BL6J小鼠为遗传背景的APP/PS1转基因小鼠作为AD的动物模型,以C57/BL6J小鼠为对照,分别于6月龄、9月龄、12月龄时处死小鼠,取小鼠海马、额叶和颞叶皮质,进行以下研究:(1)线粒体自噬相关蛋白PINK1/Parkin和p62/LC3表达的动态变化;(2)ROS水平、线粒体超微结构的动态变化;(3)NLRP3炎症小体及其相关蛋白ASC、Caspase-1的表达,炎症因子IL-1β、IL-18动态变化;(4)Aβ沉积和可溶性Aβ40、Aβ42浓度的动态变化;(5)水迷宫测试动物认知功能的动态改变。2.线粒体自噬通过调节NLRP3炎症小体减轻Aβ细胞毒性的机制研究。采用Aβ25-35干预体外培养的SH-SY5Y细胞,观察(1)线粒体自噬相关蛋白,(2)ROS、mtDNA和超微结构,(3)NLRP3炎症小体及相关蛋白和炎症因子IL-1β、IL-18的变化。然后分别采用线粒体自噬促进剂NMN、NLRP3抑制剂MCC950预处理细胞,观察对上述指标的影响。3.褪黑素通过促进APP/PS1转基因小鼠脑内细胞线粒体自噬改善动物认知功能的机制研究。经饮水给予褪黑素干预APP/PS1转基因小鼠(0.5mg/天),观察小鼠的(1)认知功能改变和对脑内(2)线粒体自噬相关蛋白,(3)ROS、线粒体超微结构,(4)NLRP3炎症小体及相关蛋白和炎症因子IL-1β、IL-18,(5)Aβ沉积和可溶性Aβ40、Aβ42的影响。4.褪黑素调控TFEB入核促进线粒体自噬在AD中的保护机制研究。(1)检测6月龄、9月龄、12月龄的APP/PS1转基因小鼠以及褪黑素干预后9月龄APP/PS1转基因小鼠脑组织细胞核内TFEB的水平,(2)观察褪黑素干预对TFEB入核的影响,(3)在SH-SY5Y细胞中过表达TFEB,检测Aβ25-35诱导的线粒体自噬及ROS水平变化。研究结果1.APP/PS1转基因小鼠模型脑内线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白随月龄增加存在动态变化。(1)6月龄、9月龄、12月龄APP/PS1转基因小鼠与同月龄的C57/BL6J小鼠对比,海马、额叶和颞叶皮质内线粒体自噬相关蛋白PINK1、LC3-II水平明显降低,Parkin、p62水平明显升高;6月龄、9月龄、12月龄APP/PS1转基因小鼠各组间比较,随月龄增长自噬相关蛋白存在动态变化;(2)电镜下对照组C57BL6J小鼠海马神经元线粒体膜结构完好,可见清晰线粒体嵴。6月龄APP/PS1转基因小鼠可见部分线粒体肿胀,存在线粒体嵴排列紊乱,并可见自噬小体;9月龄APP/PS1转基因小鼠损伤、退化线粒体数目明显增多,可见双侧膜结构溶解以及线粒体嵴破坏,轴突内可见基质变深、固缩的退化线粒体形成的髓样小体;12月龄APP/PS1转基因小鼠海马中,可见大量的髓样小体。APP/PS1转基因小鼠脑组织内ROS水平增加,且随月龄增长存在动态变化。(3)与同月龄的C57/BL6J小鼠对比,APP/PS1转基因小鼠NLRP3炎症小体及其相关蛋白Caspase-1的表达明显升高,炎症因子IL-1β、IL-18浓度明显升高,且随月龄增长存在动态变化;(4)APP/PS1转基因小鼠老年斑数量及可溶性Aβ40、Aβ42浓度随月龄增长逐渐增加,存在动态变化;(5)水迷宫测试结果显示APP/PS1转基因小鼠的逃避潜伏期、目标象限所在时间、穿越平台次数均较对照组明显延长,提示APP/PS1转基因小鼠学习及记忆能力下降,随月龄增长存在动态变化。2.促进线粒体自噬能够抑制NLRP3炎症小体活性减轻Aβ的细胞毒性。(1)线粒体自噬促进剂NMN、NLRP3抑制剂MCC950预处理可以减轻Aβ25-35导致的线粒体损伤。Aβ25-35干预导致SH-SY5Y细胞线粒体超微结构损伤;在Aβ25-35干预前使用NMN、MCC950预处理细胞,线粒体形态结构破坏减轻,ROS水平减少,提示促进自噬或抑制NLRP3炎症小体均可起到减轻Aβ细胞毒性的作用。(2)促进线粒体自噬可抑制NLRP3炎症小体;抑制NLRP3炎症小体对线粒体自噬未见明显促进作用。NMN预处理组SH-SY5Y细胞线粒体自噬相关蛋白PINK1水平升高,Parkin、p62水平降低,PINK1与LC3共定位增加,NLRP3炎症小体、Caspase-1水平降低,IL-1β、IL-18水平降低;MCC950预处理组SH-SY5Y细胞NLRP3炎症小体、Caspase-1水平降低,IL-1β、IL-18水平降低;PINK1水平略有降低,Parkin、p62水平无明显变化;PINK1与LC3的共定位无明显变化。3.褪黑素促进线粒体自噬抑制NLRP3炎症小体活性改善APP/PS1转基因小鼠认知功能。经饮水给予褪黑素干预APP/PS1转基因小鼠与安慰剂组APP/PS1转基因小鼠相比较,水迷宫测试结果显示逃避潜伏期缩短,目标象限所在时间延长,穿台次数明显增加,ROS水平明显降低,电镜下线粒体结构损伤减轻,大脑皮层及海马中Aβ淀粉样斑块数量减少,Aβ40、Aβ42浓度降低,线粒体自噬相关蛋白PINK1 水平升高,Parkin、p62 水平降低,NLRP3 炎症小体、Caspase-1、IL-1β、IL-18水平降低,免疫荧光法检测PINK1、LC3水平升高,提示给予褪黑素能够通过促进线粒体自噬,抑制NLRP3炎症小体活性,改善APP/PS1转基因小鼠认知功能。4.褪黑素调控TFEB入核促进线粒体自噬在AD中的保护机制研究。APP/PS1转基因小鼠脑组织细胞核内TFEB减少,褪黑素干预增加APP/PS1转基因小鼠脑组织中细胞核内TFEB水平。体外实验表明,褪黑素能够促进TFEB入核。在SH-SY5Y细胞中过表达TFEB能够改善增加PINK1与LC3共定位,降低ROS水平,减轻A β的细胞毒性作用。结论1.线粒体自噬、NLRP3炎症小体及其相关蛋白在APP/PS1转基因小鼠脑内存在增龄性动态改变。2.促进线粒体自噬可以抑制NLRP3炎症小体活性,在AD中发挥保护作用。3.褪黑素能够调控TFEB入核,促进线粒体自噬,调节NLRP3炎症小体活性,在AD中发挥保护作用。