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蛇毒是由多种毒素蛋白组成的“军械库”,是毒蛇捕杀和消化猎物的工具。在自然界中,某些蛇及蛇的天敌体内存在着天然的解毒蛋白,其中华游蛇就是一种抗毒能力很强的蛇。华游蛇是江西常见的一种无毒蛇,实验室曾从其血液中发现了一种新的有广谱抗蛇毒作用的磷脂酶A2抑制剂（sa PLIγ）。最近,我们给华游蛇分别注射了2倍LD50的五步蛇蛇毒（出血毒）、眼镜蛇蛇毒（神经毒）和蝮蛇蛇毒（混合毒）,24小时后华游蛇仍然存活,中毒症状不明显,皮下未见明显的出血斑。这说明华游蛇体内很可能存在抗出血毒、抗肌肉毒和抗神经毒的活性组分,我们把这些组分称为“抗毒素组”。目前还没有人对蛇的抗毒素组进行系统研究。传统抗蛇毒的研究,一般采取“分离纯化+活性检测”的模式,但在这种“单钩钓鱼”的研究模式下,经常会错失一些其他的抗蛇毒成分。因此,采取组学策略系统研究华游蛇抗毒素组,对于我们探讨华游蛇广谱抗蛇毒机制和寻找新的蛇毒抑制剂十分必要。本课题通过对上述注毒华游蛇肝脏进行转录组学测序,分析差异表达的基因及代谢通路,从整体水平解析抗蛇毒机制。构建“蛇毒亲和柱”特异性“捕获”华游蛇血清中抗毒素组分,通过质谱分析鉴定抗毒素组的组成,发现新型抗蛇毒蛋白组分。此外,对华游蛇中金属蛋白酶抑制剂基因进行克隆,为今后研究蛇血清综合抗蛇毒机理奠定基础。本研究包括三部分,主要研究方法及结果如下:研究内容一:注毒华游蛇肝脏转录组学分析方法:（1）给华游蛇分别注射五步蛇毒（2000μg）、眼镜蛇毒（200μg）、蝮蛇毒（600μg）及生理盐水。24小时后将蛇杀死,取血液和肝脏。（2）提取肝脏RNA,用Q-PCR及Western Blot检测各组肝脏中sa PLIγ表达水平。（3）取各组华游蛇血清,检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK,肌肉坏死因子）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的含量变化。（4）提取RNA,在Illumina Hi SeqTM 4000上进行转录组测序及Unigene注释,对差异基因及pathway进行富集。结果:（1）Q-PCR与Western Blot检测结果显示,sa PLIγ在注射五步蛇毒、蝮蛇毒及眼镜蛇毒组表达分相对生理盐水组明显提高。（2）三组注毒华游蛇血清中LDH、CK、ALT和AST指标较注射生理盐水的对照组无明显提高,均在正常范围。（3）华游蛇肝脏转录组学检测结果显示,转录水平上显著变化的基因主要为:毒素主要成分的抑制剂、补体、胎球蛋白及血清蛋白等,差异pathway主要为色氨酸代谢、亚油酸代谢、组氨酸代谢、糖代谢、脂代谢及PPAR信号通路等。研究内容二:华游蛇血清抗毒素组（Serum Antivenom,SAV）的分离及活性检测方法:（1）蛇毒亲和柱构建。按照NHS活化琼脂糖凝胶操作说明书将五步蛇毒偶联于填料上,制备五步蛇毒琼脂糖亲和层析柱。计算蛇毒偶联率。（2）蛇毒亲和柱验证。将五步蛇毒与佐剂充分混匀,免疫新西兰白兔,制备抗五步蛇毒血清。通过双向免疫扩散检测抗体是否产生,通过皮下注射法检测抗体的抗出血毒活性。计算蛇毒亲和柱对兔血清抗体的结合率。（3）将华游蛇血清上样至蛇毒亲和层析柱,洗去未结合组分。使用Gly-HCl（p H3.0）缓冲液,洗脱结合的组分,即华游蛇血清抗蛇毒组（SAV）。通过SDS-PAGE及质谱鉴定,分析华游蛇SAV成分。结果:（1）成功构建了蛇毒亲和层析柱。经计算,每毫升NHS活化琼脂糖凝胶偶联效率为24.32%,蛇毒亲和层析柱结合率为48.56%。（2）成功制备了抗五步蛇毒兔血清,通过双向免疫扩散实验可以看到清晰沉淀线,且兔血清抗体可充分抑制五步蛇毒的出血毒性。（3）SDS-PAGE结果显示与蛇毒亲和柱结合的华游蛇血清蛋白约有15个。经质谱鉴定,华游蛇SAV包括:胎蛋白家族蛋白（AHSG,金属蛋白酶抑制剂）、磷脂酶A2抑制剂（PLIγ）、真核翻译起始因子4A（EEF4A）、免疫球蛋白、糖及能量代谢相关酶（果糖二磷酸醛缩酶A、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、ATP合成酶亚基β及ATP合成酶亚基α）、丝氨酸蛋白酶、NLRP12、ADAMTS-7、神经营养因子3、锌指蛋白及热休克蛋白等。研究内容三:华游蛇金属蛋白酶抑制剂的分离及基因克隆方法:利用Source 30 Q阴离子交换柱及Phenyl疏水性填料分离五步蛇毒,得到金属蛋白酶（SVMP）。通过出血毒实验及EDTA螯合实验验证其活性。以相同的方法分离华游蛇血清,得到SVMP抑制剂,并通过五步蛇粗毒及SVMP出血毒抑制实验检测SVMPI的抗出血作用。根据转录组学测序结果,设计华游蛇金属蛋白酶抑制剂AHSG引物,提取肝脏RNA,利用5’-RACE技术扩增AHSG基因,测序得到该基因序列。结果:通过Source 30 Q阴离子交换柱及Phenyl疏水性填料,成功分离得到五步蛇毒SVMP及华游蛇血清中的SVMPI。出血毒实验显示9μg五步蛇毒SVMP可引起16 mm的出血斑,其出血作用可被EDTA及华游蛇SVMPI抑制,并具有量效关系。利用5’-RACE技术成功扩增出华游蛇AHSG的基因,测序表明为新基因,长度为927 bp,命名为sa AHSG。Blast结果显示,sa AHSG与虎蛇抗出血因子c HLP-B相似性为87.67%。结论:（1）华游蛇肝脏转录组学结果显示,注毒组肝脏转录水平显著变化的基因主要为出金属蛋白酶抑制剂、磷脂酶A2抑制剂、小血清蛋白及载脂蛋白等,代谢途径主要为氨基酸代谢、糖代谢、脂代谢及PPAR信号通路等。（2）使用自制的蛇毒亲和层析柱,在华游蛇血清中成功捕获了抗毒素组。该组分主要包括磷脂酶A2抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、翻译起始因子及DNA修复相关蛋白等,且具有良好的抗出血作用。（3）在华游蛇血清中分离得到大小为67 k Da的蛋白,该蛋白可抑制五步蛇毒及金属蛋白酶的出血活性,推测该蛋白为金属蛋白酶抑制剂。（4）成功地克隆了华游蛇金属蛋白酶抑制剂基因,命名为sa AHSG,分子量大小为927 bp。