目的 牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是目前国内外研究骨组织工程的理想细胞,究其原因是细胞来源容易获得,且功能多元化,近年来其研究成果不断取得突破。研究表明,长链非编码RNA(IncRNA)在间充质干细胞成骨分化过程中起着相当重要的作用。然而,IncRNA是否参与DPSCs的成骨分化尚不清楚。本研究旨在检测IncRNA是否参与DPSCs成骨分化过程。通过RNA测序(RNA-Seq)逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及分析验证,确定成骨分化不同阶段中的IncRNA表达的不同变化。结果1.TNF-α促进DPSC的成骨分化:在第7天和14天时,分别在培养牙髓干细胞的培养基中加10 ng/mL TNF-α。在第7天,用TNF-α刺激后,ALP染色显示其在成骨分化过程中强阳性表达,表明DPSCs正在进行成骨分化。而在细胞培养第14天时用TNF-α干预,ALP染色显示阳性表达增加至85-90%。这些结果表明,在牙髓干细胞分化过程中,经TNF-α诱导情况下,促进DPSC的成骨分化。2.成骨分化过程中基因表达变化:为了进一步验证牙髓干细胞成骨分化基因表达的改变,我们将第7天和第14天采集的细胞提取RNA、建库,并进行生物学分析,结果显示其基因测序质量好。而Mapping统计结果数据显示比对基因结果符合测序质量。上述结果显示在成骨分化过程中基因存在差异改变。3.在DPSCs成骨分化过程中的IncRNA表达的变化:正如先前描述的,用10 ng/ml TNF-a这种刺激成骨分化媒介处理的DPSCs。在目前的研究中,用TNF-a干预后的第7和14天后,我们收集其RNA,这时DPSCs已完成成骨分化。第二代基因测序分析显示了在第7天和14天的处理后,第77和133非编码RNA有30段非编码RNA重叠。另外,第7天在58和73处非编码RNA上调,而第14天在58和73处非编码RNA下调。这些结果表明IncRNA在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中发生了过渡性改变。随后,对DPSCs成骨分化过程中差异表达的IncRNA进行模式分析。生物信息学分析确定了 16个不同的剖面。其中6个具有统计学意义。随后,对第三个进行分析,选择其原因如下:1)该段具有最高的统计学意义;2)值得注意的是,在用TNF-α刺激后,这段所有lncRNAs的表达水平从第7天开始增加,一直保持相对高的水平直到第14天。4.lncRNA和mRNA在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的差异表达:从之前的报研究中,作者观察到在TNF-α诱导下,在第7和第14天时mRNA的改变。因此,本研究旨在探讨在DPSCs成骨分化过程中lncRNA与mRNA的改变之间的关系。通过生物信息学分析显示,我们预测第34 lncRNA与第336 mRNA转录相关,这些mRNA转录体在成骨分化过程中发生了显著的改变。《京都基因与基因组大百科全书》记录了这些mRNA转录,另外值得注意的是,“PI3K-Akt信号通路”和“MAPK信号通路”在成骨细胞分化中发挥了关键作用。5.IncRNA差异表达的分析:为了进一步验证RNA测序的结果,利用RT-qPCR技术,在用TNF-a刺激后的第7天和第14天,测量第三层面的四个预测IncRNAs的表达的改变。结果显示在用TNF-α刺激后的第7天,四段IncRNAs都在同样增加,而在第14天这些表达的改变不相同,其也是符合基因测序数据。6.由TNF-α诱导的高效的成骨分化需要lncRNAXIST:目前,lncRNA是否和如何参与成骨细胞分化的机制尚不清楚。为了研究这一点,我们选取一个已验证的lncRNA、即XIST,检测其对成骨细胞分化的影响。经RT-qPCR证实,特异性的siRNA能够下调DPSCs成骨分化中的XIST表达。经TNF-α诱导的第14天后,在之前培养的DPSCs,用siRNA转染的XIST的抑制剂显著降低成骨细胞细胞核的磷酸化。因此,对于有效的成骨分化,需要一个lncRNA,即XIST,这可能与此过程中相关的一组mRNA中的来调节作用实现。结论(1)IncRNA的表达在牙髓干细胞受TNF-α刺激后成骨分化过程中发生了改变。(2)在用TNF-α刺激后,lncRNAs的表达水平随着时间轴增加。(3)lncRNA的表达和mRNA在牙髓干细胞成骨分化过程中密切相关。(4)由TNF-α诱导的高效的成骨分化需要lncRNA XIST。