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目的:高血糖加重了血管内皮功能障碍,导致糖尿病患者易患冠状动脉粥样硬化心脏病(coronary heart disease,CHD),EPCs(Endothelial progenitor cells)可以直接参与受损内皮的修复并提高其功能。然而,在高糖环境下EPCs功能显著降低。因此,需要可以提高EPCs生物学功能的方法。尼可地尔是兼具类硝酸酯作用及三磷酸腺苷敏感性钾通道(K+ATP channel)开放功能。同时,尼可地尔也是一种心血管系统保护药物。但尼可地尔是否可以提高高糖环境下EPCs的功能以及潜在的机制未知。在该研究中,我们探究了高糖环境下尼可地尔对EPCs的作用机制。方法:首先使用密度梯度离心法分离出大鼠骨髓单个核细胞,结合差速贴壁法以及改良后新增的集落挑选法,在培养过程中不断纯化EPCs。通过吞噬试验,免疫荧光检测,流式细胞术鉴定,增殖实验,活力检测,迁移试验和体外成管实验多方面鉴定EPCs。然后探究大鼠EPCs在不同浓度葡萄糖条件下的增殖、迁移及血管形成情况,为后续高糖环境EPCs病理生理机制探究提供参考。最后在高糖环境下(25 mM),用尼可地尔处理EPCs。分别使用mitoKATP阻断剂5-HD,CXCR4受体阻断剂AMD3100,PI3K阻断剂LY294002以及eNOS阻断剂L-NAME去探索相关机制。CCK-8增殖检测和MTT实验检测EPCs增殖和细胞活力。EIisa方法分析EPCs分泌SDF-1α含量。细胞的迁移能力和体外血管生成能力也分别使用24-well transwell chamber以及体外成管实验检测。高糖诱导的细胞凋亡使用Annexin V-FITC/PI和Western blotting鉴定。SDF-1α/CXCR4/PI3K信号通路相关的蛋白表达情况通过Western blotting确定。结果:1.经过改良方法培养的EPCs早期呈现出纺锤形,晚期出现典型的铺路石样集落。95.7±3.8%具有吞噬Dil-acLDL和结合FITC-UEA-I能力。2.纯化后的EPCs免疫荧光发现表达CD31、VEGFR2、vWF、eNOS及VE-cadherin,说明具有内皮细胞特性。3.纯化后的EPCs流式结果显示,一次,两次及三次纯化后CD34+和VEGFR2+细胞比例分别为73.4±2.8%,76.8±3.1%,80.1±3.4%,明显高于未纯化细胞(P<0.01)。说明培养的EPCs纯度较高。4.1×105个/ml细胞浓度其增殖和活力最好(P<0.01),并应用于后续实验。所培养细胞具有良好的迁移能力及体外成管能力。5.在建立的高糖模型中,葡萄糖浓度在25 mM达到对EPCs功能达到最大抑制程度。此时与对照组相比EPCs增殖能力(P<0.01),迁移能力(P<0.01),体外成管能力(P<0.01)最低。6.尼可地尔显著促进了高糖环境下EPCs的活力、增殖、迁移和体外成管能力(p<0.01),尼可地尔增加了 SDF-1α的含量(P<0.01),抑制了高糖诱导的EPCs凋亡(P<0.01)。7.尼可地尔的保护作用,可以被5-HD阻断,因此尼可地尔通过开放mitoKArP通道改善EPCs功能。此外,尼可地尔增加CXCR4(p<0.05)、p-Akt(P<0.05)、p-eNOS(P<0.05)、Bcl-2(P<0.05)表达,减少 cleavedcaspase3(P<0.01)表达。8.使用信号通路阻断剂AMD3100、LY294002和L-NAME预处理后,阻断了尼可地尔对SDF-1α/CXCR4/PI3K信号通路的激活。因此,SDF-1α/CXCR4/PI3K是mitoKATP通道的下游通路。结论:1.通过形态学观察细胞生长过程中形态变化,增殖实验和活力检测观察细胞生长情况,吞噬试验及细胞表面标志物的鉴定确定细胞具有内皮细胞特性,迁移试验确定细胞具有迁移特性,体外成管实验确定细胞具有血管生成能力。流式检测细胞纯化后的纯度,确定所培养细胞为EPCs。2.提供了一种改良的、有效的分离培养纯化及鉴定骨髓来源的EPCs方法。3.EPCs在高糖环境下随着葡萄糖浓度升高呈浓度依赖方式被抑制,其增殖、迁移及体外血管生成能力显著降低。4.建立适合探究高糖环境下EPCs生物学功能的高糖模型。5.尼可地尔以浓度依赖方式改善高糖环境下EPCs活力、增殖、迁移、血管生成,同时抑制了高糖诱导的细胞凋亡,并促进了 SDF-1α的分泌。6.尼可地尔是通过开放mitoKATP通道并激活下游SDF-1α/CXCR4信号通路,进一步激活PI3K/Akt/eNOS信号通路,发挥改善高糖环境抑制骨髓来源EPCs的功能的作用。