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淀粉是植物体内重要的储能物质,也是人类的主要食物和工业生产的原料来源。淀粉中直链淀粉和支链淀粉的相对含量是淀粉品质的主要决定因素。淀粉分支酶是淀粉合成过程中的关键酶,它催化葡萄糖残基以a-1,6糖苷键连接形成葡聚糖分支,从而改变直链淀粉和支链淀粉的比例,影响淀粉的理化性质。玉米淀粉分支酶Ⅱ b(ZmSBEⅡb)对玉米胚乳直链淀粉含量的影响很大,其编码基因的突变(玉米ae突变体)可使玉米胚乳中直链淀粉的含量达到50%。因此,ZmSBEⅡ b及其互作因子的作用机理的研究,对揭示淀粉特别是直链淀粉合成调控的分子机理具有重要理论意义。
本项研究根据原有的酵母双杂交对ZmSBEⅡ b互作因子的高通量筛选结果,克隆出了ZmSBEⅡ b互作因子ZmSIP1编码基因的全长序列,分析了ZmSBEⅡ b同ZmSIP1的互作结构域,确定了ZmSBEⅡ b同ZmSIP1的亚细胞定位,并检测了ZmSBEⅡb同ZmSIP1在不同玉米品种不同器官以及高直链玉米籽粒发育过程中的表达状况。主要研究结果如下:
1、利用同源克隆结合5 RACE的方法,克隆出ZmSIP1的全长序列(其Genebank登录号为FJ766095),ORF框大小为1971 bp,编码657个氨基酸,分子量为75 KD,等电点为8.7,含有一个保守结构域DUF590(功能未知)。
2、构建ZmSBEⅡb及其互作因子ZmSIP1的不同结构域片段,确定有效互作结构域。结果表明ZmSBEⅡb三维结构的维持是与ZmSIP1互作最为理想的,其中ZmSBEⅡ bP7,即ZmSBEⅡ b的catalytic domain和C-terminal all-beta domain在与ZmSIP1的互作上具有较大的贡献。
3、利用烟草原生质体转化方法确定了ZmSBEⅡ b和ZmSIP1的亚细胞定位。结果表明,ZmSBEⅡb定位于叶绿体中,而ZmSIP1则定位于叶绿体周围的细胞质中。因此认为ZmSIP1有可能同ZmSBEⅡ b在细胞质内的翻译后修饰有关。
4、应用半定量RT-PCR技术,检测了不同品种玉米不同器官中ZmSBEⅡb和ZmSIP1的表达状况。结果表明,ZmSBEⅡ b的表达量与玉米籽粒中直链淀粉含量之间存在负相关的关系,存直链淀粉含量更高的品种Hamy-ae的籽粒内,ZmSBEⅡb的表达水平相对较低,而ZmSIP1在不同品种玉米胚乳中表达模式与ZmSBEⅡb几乎一致,在Hamy-ae的籽粒内丰度较低。因此,ZmSIP1和ZmSBEⅡb可能是玉米籽粒中影响直链淀粉合成的关键因子,ZmSIP1和ZmSBEⅡ b表达量的高低决定了玉米籽粒中直链淀粉含量的高低,甚至可能决定玉米籽粒淀粉的品质。