【摘 要】
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目的:研究异鼠李素针对烟曲霉菌的抑菌特性,以及在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用及机制。方法:1.采用微量稀释法检测异鼠李素对烟曲霉菌的最低抑菌浓度（MIC）;细胞计数试剂盒（CCK-8）检测其对永生化人角膜上皮细胞（HCECs）和小鼠巨噬细胞（RAW264.7）的毒性,筛选出安全的有效抗真菌浓度。2.采用扫描电子显微镜观察异鼠李素对烟曲霉菌菌丝形态的影响;对异鼠李素处理的烟曲霉菌菌丝进行碘化丙啶
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目的:研究异鼠李素针对烟曲霉菌的抑菌特性,以及在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用及机制。方法:1.采用微量稀释法检测异鼠李素对烟曲霉菌的最低抑菌浓度（MIC）;细胞计数试剂盒（CCK-8）检测其对永生化人角膜上皮细胞（HCECs）和小鼠巨噬细胞（RAW264.7）的毒性,筛选出安全的有效抗真菌浓度。2.采用扫描电子显微镜观察异鼠李素对烟曲霉菌菌丝形态的影响;对异鼠李素处理的烟曲霉菌菌丝进行碘化丙啶（PI）染色,检测细胞膜通透性的改变。3.使用异鼠李素干预经烟曲霉菌刺激后的HCECs和RAW 264.7细胞,用PCR法检测TLR-2、TLR-4、Dectin-1、IL-1β和TNF-α的表达,研究异鼠李素体外抗炎作用。4.建立烟曲霉菌感染的C57BL/6小鼠角膜炎动物模型,使用异鼠李素溶液以滴眼的给药方式进行进行局部治疗5天,采用裂隙灯照相、临床评分观察小鼠角膜炎的愈后;采用菌落计数法检测感染角膜中真菌残存量,过碘酸希夫（PAS）染色观察角膜组织中真菌负荷及菌丝侵袭深度。5.采用角膜组织免疫荧光染色、苏木精-伊红（HE）染色法观察异鼠李素对中性粒细胞募集的影响,髓过氧化物酶（MPO）实验对角膜中性粒细胞进行定量测定。6.通过PCR,ELISA和Western Blot检测烟曲霉菌感染小鼠角膜组织中相关模式识别受体TLR-2、TLR-4、Dectin-1及炎症因子IL-1β、TNF-α的基因及蛋白表达,研究异鼠李素在体内的抗炎作用。结果:1.异鼠李素对烟曲霉菌的MIC90为80μg/mL,并且药物浓度为80μg/mL时有效抑制烟曲霉菌菌丝的生长。CCK-8实验显示,异鼠李素浓度小于160μg/mL时不影响HCECs和RAW 264.7的细胞活性。2.在体外抗真菌实验中,80μg/mL异鼠李素明显改变烟曲霉菌菌丝形态,并增加细胞膜的通透性。3.烟曲霉菌刺激HCECs和RAW 264.7细胞后,升高的TLR-2、TLR-4、Dectin-1、IL-1β、TNF-α基因水平可被异鼠李素显著抑制。4.在真菌性角膜炎动物模型中,异鼠李素处理后明显改善小鼠角膜炎预后,角膜混浊程度较轻,溃疡面积减小,并且未发生角膜穿孔,感染后第3、5天异鼠李素治疗组炎症临床评分明显低于对照组。5.PAS染色显示感染后第3天,异鼠李素处理可抑制角膜中菌丝生长以及向角膜组织深层侵袭。平板计数实验显示感染后第5天,异鼠李素显著降低感染角膜组织中的真菌残存量。6.异鼠李素治疗能够减少真菌感染角膜中炎症细胞浸润,减轻角膜水肿,抑制中性粒细胞在炎症部位的募集,MPO明显下降。7.在感染后第1、3和5天,异鼠李素明显抑制模式识别受体TLR-2、TLR-4、Dectin-1和炎症因子IL-1β、TNF-α的基因和蛋白表达。结论:体外实验表明异鼠李素具有明显的抗烟曲霉菌及抑炎作用。体内实验证明,异鼠李素通过抑制烟曲霉菌生长,减少中性粒细胞的浸润以及抑制模式识别受体和促炎因子的表达,在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中发挥抑真菌及抗炎作用。
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