论文部分内容阅读
黄萎病是棉花主要病害之一,常常导致棉花生产的经济损失。在我国,棉花黄萎病主要是由病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的。随着基因编辑技术的发展,CRISPR/Cas 9系统已应用于真菌基因功能研究,其中U6启动子是驱动sgRNA转录的重要元件之一,但在大丽轮枝菌中U6启动子序列长度还不清楚。本研究旨在分析大丽轮枝菌内源性U6启动子的长度,为CRISPR/Cas 9系统应用于大丽轮枝菌中提供依据。棉帚霉菌(Scopulariopsis gossypii)是帚霉属中迄今发现的唯一能侵染植物的特例。原先研究发现,用通用引物不能从该种中扩增ITS区,影响了分类研究。本研究利用三代测序获得的rDNA序列,分析和揭示了通用引物不能扩增的原因,并评价了 ITS区在帚霉属中对分类的作用。1.大丽轮枝菌U6启动子的研究为分析U6启动子的长度,利用一步连接法构建四个不同长度U6启动子敲除载体,采用PEG介导法对载体进行原生质体的转化。通过抗性筛选和PCR鉴定,获得不同长度U6启动子的突变体。为了明确不同长度的U6启动子对U6 snRNA表达量的影响,选择四个代表性突变体△VdU6-5P(527bp)、△VdU6-4P(423bp)、△VdU6-3P(323bp)和△VdU6-2P(230bp),通过 qRT-PCR 检测不同突变体U6 snRNA表达量。检测结果表明,与野生型表达量相比,突变体△VdU6-5P、△VdU6-4P、△VdU6-3P和△VdU6-2P的相对表达量分别为 0.54、0.44、0.43和0.43,显示不同长度的U6启动子间对转录活性没有显著影响,230 bp U6启动子序列可用于大丽轮枝菌CRISPR/Cas 9基因编辑中的内源性启动子元件。2.棉帚霉菌核糖体DNA序列的研究分析棉帚霉菌三代转录组测序结果,得到一条2578 bp的棉帚霉菌rDNA序列,将其在NCBI上进行blast搜索,结果显示该序列与短帚霉菌(S.brevicaulis)的一致性为97%。用真菌的9对通用引物与棉帚霉菌rDNA序列进行比较分析,rDNA SSU位点序列不完全匹配,通用引物区碱基差异在2-5个之间,显示了棉帚霉菌SSU区的碱基发生了突变。在此基础上,依据棉帚霉菌rDNA序列变化,对9条通用引物进行修饰,并通过PCR扩增对修饰的通用引物进行了验证。为了评价ITS区在真菌系统发育中分类作用,分别用四个位点序列(ITS、LSU、TEF1及TUB)和三个位点(LSU、TEF1及TUB)序列,采用最大似然法分别构建系统发育树。系统发育树分析结果显示,虽然三个位点序列的发育树已经能将不同的种清楚区分(不含ITS),但四个位点序列的系统发育树能反应同种内不同分类单元间的密切关系,显示ITS区序列对帚霉属真菌分类有重要作用。