莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是隶属于绿藻门、团藻目、衣藻属的一种单细胞真核藻类,在缺氧胁迫的环境中,衣藻细胞内的氢化酶催化质子和电子生成氢气,是生物制氢的模式物种。但目前实验条件下氢气的产量无法达到大规模工业化的生产要求,因此从基因转录水平,阐述衣藻胁迫产氢的分子机理以及挖掘出与衣藻产氢相关的重要功能基因,可以为日后构建高产氢的藻株提供实验理论依据。提取莱茵衣藻cc124(以下简称为衣藻)不同产氢时期和对照组相应时间的总RNA,利用Illumina HiSeq3000测序平台开展RNA-Seq,并结合生物信息学方法,分析衣藻产氢过程中各时期转录组间的基因表达差异。同时检测衣藻产氢过程中淀粉、葡萄糖、甲酸、乙酸以及乙醇五种代谢物的含量,从代谢物的角度来分析衣藻产氢过程中碳水化合物的变化。得到的主要结果如下:(1)绘制莱茵衣藻产氢速率图,结果表明胁迫培养至96 h时产氢速率最高,144 h时氢气产量达到最大为3891.07μL/mg Chl。可将衣藻的产氢过程分为3个阶段:启动期(0 h-24 h),旺盛期(24 h-96 h)和衰退期(96 h-144 h)。(2)总共构建9个转录组cDNA文库(包括产氢启动期(0 h,24 h)、旺盛期(72 h,96 h)、衰退期(144 h)以及相应对照组的时间点),每个文库共获得6G左右的2×100 bp的原始数据。其中0 h样本获得61,013,046条raw reads,胁迫产氢组4个样本共获得251,403,358条raw reads,对照组4个样本共获得255,345,282条raw reads,表明各个样本的测序产量均匀一致。基因表达量注释结果表明9个样本表达的所有基因的个数为14849个。(3)通过对衣藻产氢过程中0 h-144 h间所表达的差异基因进行聚类分析,可分为4个类群,再对每一类群基因进行GO功能富集分析,结果表明:胁迫产氢下调的cluster1差异表达基因的功能主要集中在光合作用、细胞内碳水化合物代谢、色素合成及代谢过程等;与产氢正相关的cluster3和cluster4差异表达基因主要功能是蛋白酶体、蛋白质代谢过程、羧酸生物合成和代谢、淀粉生物合成、细胞内氨基酸及衍生物合成与代谢过程、质子转运、氢转运等;而cluster2中的基因无论在胁迫组还是在正常组中都表现为24 h下调表达,与衣藻产氢的关联性不大。(4)对产氢动态变化过程中的差异表达基因进一步采用Kobas软件进行KEGG富集分析,结果表明:与硫代谢相关的基因显著上调,并一直持续到产氢旺盛期,直到衰退期时才下调表达,这与衣藻产氢培养是在缺硫培养的条件有直接关系;而光合作用、光合作用天线蛋白、糖酵解、TCA循环、丙酮酸代谢以及为衣藻细胞提供还原剂的磷酸戊糖途径受到胁迫条件的强烈抑制,尤其在产氢旺盛期阶段,基因显著下调表达;另一方面,在产氢启动期衣藻大量合成一些氨基酸,以促进细胞生长修复,维护细胞膜;脂肪酸合成和代谢相关基因在产氢启动期下调表达,但在产氢中后期脂肪酸代谢、尤其是不饱和脂肪酸合成通路的基因显著上调表达。(5)糖酵解通路相关基因在产氢初期表达上调,而在中后期下调表达,与衣藻产氢速率趋势一致。经初步筛选和挖掘,糖酵解通路中与衣藻产氢正相关的基因主要有:编码hk、pyk、pfk、adh的6条基因序列,其中hk、pyk、pfk为三个限速酶,adh在产氢中后期与衣藻产氢的发酵代谢有关;与衣藻产氢负相关的基因主要有:编码pyk、pdhb的4条基因序列。其中与产氢正相关的编码pyk的为cre03.g144847和cre05.g234700两条基因序列;与产氢负相关的编码pyk的为cre02.g147900和cre12.g533550两条基因序列。(6)丙酮酸通路在产氢过程中受到强烈抑制,尤其是旺盛期。且丙酮酸是衣藻产氢过程中的最关键的中间产物。经分析,丙酮酸通路中与衣藻产氢正相关的基因主要有:编码pdhb和mdh的2条基因序列,这两种酶可以进一步调节三羧酸循环通路。与衣藻产氢负相关的基因主要有:编码dld、dlat的2条基因序列。(7)三羧酸循环是衣藻细胞内糖类、蛋白质和脂肪共同的一个通路。该通路中与衣藻产氢正相关的基因主要有:编码cs、idh、ogdh、lsc1和sdhc的6条基因序列,其中cs、idh、ogdh为该通路中的限速酶。与衣藻产氢负相关的基因与丙酮酸通路中负相关的基因相同。(8)衣藻产氢均是在弱光照或者黑暗的情况下进行的,因此光合作用中大部分的转录本均下调,但编码petj、atfd2、lhcbm7和lhca3的4条基因上调表达,主要是调节psii、psi和细胞色素b6f复合物,从而调节光合电子传递链。表明缺硫之后,光合作用并没有经历一个简单的下调过程,而是一个更加复杂的过程。(9)衣藻在缺硫培养基中产氢,硫代谢通路中与产氢正相关的基因主要有:产氢启动期内,编码sat、cysk、cyse、cysu、cysp的5条基因序列;产氢旺盛期内,编码sat和sir的2条基因序列以及产氢衰退期编码tst的1条基因序列。与产氢负相关的基因主要有:编码cysq、cysk和metb的3条基因序列。(10)莱茵衣藻cc124在胁迫产氢的过程中,代谢物的分析结果表明:产氢初期(0-72h),衣藻体内开始积累淀粉;产氢中后期(96h-144h),分解淀粉,淀粉减少;淀粉降解变为葡萄糖,葡萄糖含量随着胁迫时间的延长先增加后减少;乙酸能够使衣藻进行呼吸作用,以便消耗掉体系中的氧气,因此产氢过程中,乙酸含量有规律的减少;而甲酸和乙醇是衣藻胁迫产氢过程中发酵代谢的产物,因此体系达到厌氧状态时可以检测到甲酸和乙醇,并且随着胁迫时间的延长,含量逐渐增加。综上所述,莱茵衣藻cc124的产氢代谢过程中,硫代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢以及参与这些代谢过程调控的转录调控因子,是影响衣藻产氢效率的主要因素。