论文部分内容阅读
[目的] 1.研究microRNA-155(miR-155)对正常环境及氧化低密度脂蛋白刺激下脑血管内皮细胞的活性氧的生成、一氧化氮生成、凋亡、粘附、增殖、迁移以及血管形成能力的影响; 2.探讨miR-155对脑血管内皮细胞上述功能影响的分子机制。 3.分析循环中miR-155水平与缺血性脑卒中患者脑损伤的相关性。 [方法] 将携带miR-155干扰片段的慢病毒(Lv-si155)以及不含干扰片段的对照慢病毒(Lv-NC)分别感染人脑血管内皮细胞(HBMEC)，分别得到miR-155沉默的HBMEC(HBMEC-si155)和正常对照组的HBMEC(HBMEC-NC)。检测miR-155沉默后HBMEC在正常培养条件下和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激下的细胞功能变化。利用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)结合流式细胞检测分析ROS的生成量;采用总一氧化氮生成试剂盒检测NO生成;运用Hoechst33258凋亡检测试剂盒及AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪检测HBMEC凋亡率;白细胞粘附实验检测HBMEC的粘附能力;细胞划痕实验和MTT分别检测miR-155对细胞迁移和增殖的影响;体外血管形成试剂盒检测细胞的血管形成能力;Western blot和Real time PCR检测PI3K、p-Akt/Akt、p-EGFR/EGFR、pERK/ERK、p-p38/p38、caspase3以及粘附分子ICAM-1的表达水平。利用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路检测miR-155对HBMEC ROS和NO的生成及p-Akt/Akt表达的影响。 收集广东医学院附属医院缺血性脑卒中患者及同期门诊健康体检者外周血共237例，其中，缺血性脑卒中组163例、健康对照组40例、高危组34例。将缺血性卒中患者按病程分为超急性期(0～6小时)、急性期(6～72小时)、亚急性期（3天～14天）、慢性期（＞14天）。并且将发病3天内的患者按改良TOAST标准进行病因分型，分为动脉粥样硬化血栓形成(AT)、小动脉病变(SAD)、心源性栓塞(CE)和不明原因卒中(SUD)4个亚型。NIHSS评分评估患者在卒中急性期神经功能损伤程度。采用Real time PCR检测外周血血浆中miR-155的表达水平。 [结果] 1.MiR-155水平检测:real-time PCR检测发现HBMEC-si155中miR-155的表达水平约为对照组细胞(HBMEC-NC)的35％(P＜0.01)。 2.Ox-LDL提高HBMEC中ROS的生成(P＜0.05); miR-155敲除减少正常培养条件及ox-LDL刺激下HBMEC中的ROS生成(P＜0.01)。PI3K抑制(LY294002)可增加HBMEC-si155的ROS生成（P＜0.05）。 3.Ox-LDL抑制HBMEC中NO的生成(P＜0.05); miR-155沉默后，HBMEC在正常培养条件及ox-LDL刺激下NO生成均明显增多(P＜0.01); PI3K抑制(LY294002)后的HBMEC-si155生成NO减少(P＜0.01)。 4.Ox-LDL和饥饿处理(SD)均促进HBMEC凋亡(P＜0.01);并且，ox-LDL能够加重SD诱导的HBMEC凋亡(P＜0.01); miR-155沉默后抑制HBMEC凋亡(P＜0.01)。 5.Ox-LDL促进HBMEC对白细胞HL60的粘附能力(P＜0.05); miR-155敲除减少正常培养条件及ox-LDL刺激下HBMEC粘附HL60细胞的数量（P＜0.01）。 6.HBMEC在ox-LDL刺激下增殖能力增强(P＜0.05); miR-155敲除后进一步促进在正常培养条件及ox-LDL刺激下HBMEC的增殖(P＜0.05）。 7.Ox-LDL促进HBMEC迁移(P＜0.01); miR-155敲除后进一步促进在正常培养条件及ox-LDL刺激下HBMEC的迁移(P＜0.01)。 8.Ox-LDL抑制HBMEC形成血管的能力(P＜0.01); miR-155敲除增强正常培养条件及ox-LDL刺激下HBMEC血管形成能力(P＜0.01)。 9.Ox-LDL提高HBMEC中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ ERK、p-p38/ p38和cleaved caspase-3蛋白的表达水平，上调ICAM-1 mRNA的表达，降低PI3K、Akt蛋白表达水平（P＜0.05）。miR-155敲除降低在正常培养条件及ox-LDL刺激下HBMEC中的p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38/p38和cleaved caspase-3蛋白表达及ICAM-1 mRNA的表达水平，增加PI3K和Akt的蛋白表达水平(P＜0.05)。 10.缺血性脑卒中组及高危组循环中miR-155的水平高于对照组(p＜0.01)，而卒中组高于高危组(P＜0.01)。 11.缺血性脑卒中超急性与急性期患者的循环miR-155表达水平高于亚急性与慢性期(P＜0.01);超急性与急性期的循环miR-155无显著性差异（P＞0.05）;亚急性期的循环miR-155高于慢性期（P＜0.05）。 12.比较急性期的4个缺血性脑卒中亚型（动脉粥样硬化血栓形成、心源性栓塞、小动脉病变与不明原因卒中）患者的循环miR-155水平发现，AT型患者显著高于其它3个亚型(P＜0.05)，而SAD、CE和SUD之间两两比较未见显著性差异(P＞0.05)。 13.Spearman等级相关分析显示，缺血性脑卒中患者急性期循环miR-155水平与入院NIHSS评分呈正相关(r=0.619，p＜0.01);根据入院NIHSS评分≥7或＜7将卒中患者划分成2组，单变量分析显示:NIHSS评分＜7组的循环miR-155水平(％)显著低于NIHSS评分≥7组(P＜0.01)。 [结论] 1.MiR-155促进入脑血管内皮细胞ROS生成、凋亡、白细胞粘附能力，同时降低其NO生成、细胞增殖、迁移、血管形成能力。 2.MiR-155通过调节PI3K/Akt通路促进人脑血管内皮细胞的ROS生成，抑制NO生成。并上调caspase-3和ICAM-1的表达。同时抑制EGFR、ERK、p38MAPK的表达。 3.缺血性脑卒中患者循环中的miR-155表达水平升高，且在超急性期和急性期更为明显，并在AT亚型中显著性升高。 4.缺血性脑卒中发病3天内的循环miR-155水平具有评估缺血性脑卒中神经功能损伤程度的价值。