论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenieritis of swine, TGE)是一种以仔猪出现严重腹泻、呕吐和脱水为特征的高度接触性肠道传染病,其病原为猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus of Swine, TGEV)。临床上TGEV与同种属的其他腹泻病毒难于区分,致使对该病的诊断和预防带来了很大困难。由于单克隆抗体对抗原的识别具有特异性,因此在疫病病原的诊断中优势突出。而单克隆抗体识别的抗原表位,有助于了解TGEV抗原结构与功能的关系,对该病的诊断具有重要意义。本研究首先用差速离心的方法纯化TGEV,以纯化病毒为免疫抗原,经皮下多点注射免疫BABL/c小鼠,三次免疫后进行细胞融合,利用TGEV感染的PK15细胞进行间接免疫荧光检测,筛选阳性杂交瘤细胞株,并利用有限稀释法克隆阳性细胞株,对经三轮以上筛选为阳性的细胞株进行扩大培养和低温冻存,同时利用BABL/c小鼠制备腹水进一步验证,试验结果表明我们获得了一株能稳定分泌抗TGEV抗体的杂交瘤细胞株,命名为4E2。利用纯化的TGEV对4E2单克隆抗体进行Western blot分析,结果显示单克隆抗体4E2特异性识别约为47kD的N蛋白。为了进一步确定单抗4E2所识别的病毒蛋白,我们克隆获得了TGEV的N基因,同时将N基因分成N1和N2,分别将其亚克隆至原核表达载体pGEX6p-1、pET-30a中,获得重组表达载体pGEX6p-N、pET-30a-N1,并分别在大肠杆菌中进行了表达,利用TGEV阳性鼠血清对表达产物进行Western blot分析,证实表达的两个融合蛋白都具有较好的反应活性。然后分别以表达的融合蛋白为抗原,对获得的单抗4E2进行间接ELISA和Western blot检测,结果显示单抗4E2可以特异性识别TGEV N蛋白以及N1蛋白,进一步证实我们获得的单抗4E2是针对TGEV N蛋白,而且其所识别的抗原表位位于N蛋白N端192个氨基酸,本研究结果为今后临床中对TGEV的可靠性诊断提供了有效工具。为弄清近年在上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,我们随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测,结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)阳性,而猪流行性腹泻病毒(PEDV)和TGEV均为阴性：根据GenBank公布的PoRV参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析,结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356bp, VP7基因大小为1100bp,根据结果分析,我们确定此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的PoRV引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。