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目的：(1)利用全基因组DNA甲基化芯片(The Illumina Infinium Human Methylation450),检测酒依赖(alcohol dependence, AD)患者及其未患病同胞全基因组水平DNA甲基化程度,筛选出两者之间甲基化程度具有差异的位点,探讨这些差异性位点所在基因甲基化状态和酒依赖之间的关联。利用焦硫酸测序技术,对某些甲基化程度差异性位点进行验证分析,比较芯片结果与焦硫酸测序结果的相关性,增加可信度。(2)采用病例对照放大样本量分析高差异程度基因,初步了解表观遗传在酒依赖病理机制中的作用和意义。对象与方法：1.以精神障碍诊断与统计手册第四版(Diagnostic and Statistical Manual of mental disorder-Ⅳ, DSM-Ⅳ)轴I障碍定式临床检查(Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis I Disorders, SCID-Ⅰ)为诊断标准,将诊断为酒依赖者招募为病例组,并以酒精依赖性疾患识别测验量表(The Alcohol Use Disorders Identification Test, AUDIT)评定病例组酒依赖严重程度,应用生活事件量表(LES)、 Wheatley应激量表了解负性生活事件及出现酒依赖的可能应激因素；以与病例组年龄、文化程度、地域相匹配的原则招募健康对照组；同时,在知情同意的基础上,选取酒依赖者家庭中一个尚未出现酒依赖(患病)状态的同胞纳入未患病同胞对组。本课题共招募两组研究对象。一组是AD及未患病同胞对10对,均为男性。另一组是病例组(63例)和健康对照组(65例),均为男性。所有入组研究对象均来自新乡市市区及县区。2.抽取所有研究对象外周静脉抗凝血8～10ml,利用DNA提取试剂盒(Qiagen,德国)提取各样本基因组DNA,并对基因组DNA进行亚硫酸转化处理及PCR扩增。利用全基因组甲基化芯片(The Illumina Infinium Human Methylation450)对10对AD同胞对进行基因组DNA甲基化检测分析并得出原始数据。3.运用BeadStudio Methylation Module v3.2软件分析数据。甲基化程度的高低依据扫描回馈结果average Beta值(AVB,反映样本CpG位点甲基化程度,数值越大,越趋近于1,甲基化程度越高),根据|DiffScore|≤20进行甲基化程度差异性位点的筛选。4.通过焦硫酸测序技术,利用10对同胞对(与全基因组DNA甲基化芯片检测分析对象相同)外周血DNA,检测GABRP、ALDH1L2、DBH、及GAD1基因甲基化程度,并与芯片结果进行相关分析,观察芯片结果与焦硫酸测序结果的相符情况,验证芯片技术的可靠性。5.运用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery6.7(DAVID; http://abcc.ncifcrf.gov)、Gene Ontology (GO; http://www.geneontology.org/)和the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; http://www. genome.jp/kegg/)对差异性位点进行相关通路分析。6.通过焦硫酸测序技术,利用病例组(63例,不包括上述10对同胞对中的酒依赖患者)与健康对照组(65例)外周血DNA,对SSTR4基因和GABRP的差异性位点进行甲基化状态检测分析,验证基于同胞对的分析结果。结果：1.临床研究(1)AD平均年龄为(44.9±5.9)岁,未患病同胞平均年龄为(44.2±7.2)岁,两组年龄无显著性差异(P>0.05)。病例组年龄(39.1±7.3)岁,健康对照组年龄(39.6±8.1)岁,两组年龄无显著性差异(P>0.05)。(2)10对酒依赖同胞对在AUDIT、 LES及Wheatley应激量表评分的差异性均具有统计学意义,AUDIT (t=8.246, P<0.05), LES (t=5.453, P<0.05), Wheatley应激量表(t=7.981,P<0.05)。(3)63例酒依赖患者与65例健康对照在AUDIT. LES及Wheatley应激量表评分的差异性均具有统计学意义,AUDIT (t=16.301, P<0.05), LES (t=14.440, P<0.05), Wheatley应激量表(t=21.779,P<0.05)。2.10对酒依赖同胞对全基因组甲基化芯片检测结果及验证通过芯片检测分析及结果分析,共有865个低甲基化位点和716个高甲基化位点,这些位点涉及到827个已知基因。最高甲基化位点位于GABRP基因,最低甲基化位点位于SSTR4基因。10对同胞对焦硫酸测序结果与芯片结果相关性较好,GABRP基因、ALDH1L2、 GAD1及DBH基因的R2依次为：0.998,0.954,0.986,0.996,显示芯片检测结果可靠。3.生物学通路分析通过GO分析,这些差异性位点参与13条生物学过程、19条分子功能和20条分子构成。通过KEGG分析,130个包含差异位点的基因中,33个基因属于代谢通路。4、病例对照验证分析病例组SSTR4基因与对照组SSTR4基因的甲基化程度差异具有统计学意义(t=14.723,P<0.05),并且病例组SSTR4基因的CG%比例低于对照组。病例组GABRP基因与对照组GABRP基因的甲基化程度差异具有统计学意义(t=32.622,P<0.05),并且病例组GABRP基因的CG%比例高于对照组。这与芯片结果相同,两组方法的结果比较相符,相互验证。结论：1.男性酒依赖患者与同胞对及健康对照相比,遭遇较多负性生活事件及有较高的应激水平,说明环境因素在酒依赖的形成与维持过程中起到一定作用。2.男性酒依赖患者存在全基因组水平DNA甲基化异常,共有865个低甲基化位点和716个高甲基化位点,这些位点涉及到827个已知基因。差异性甲基化位点参与了许多条生物学通路。DNA甲基化变化可能在酒精使用障碍病理机制中起到重要作用。3.最高甲基化位点位于GABRP基因,最低甲基化位点位于SSTR4基因。SSTR4基因是新发现的可能与酒依赖相关的基因,它的甲基化程度的改变可能与酒依赖有关。