神经反射通路是中枢神经系统活动的形态学基础，参与构成神经通路的神经元可分为传入神经元、中间神经元和传出神经元三大类，中间神经元数量最多，其形态特征和机能状态直接影响到神经系统的反射活动。神经化学的研究表明，中枢神经系统的中间神经元含多种化学成分，包括钙结合蛋白、降钙素基因相关肽、神经肽Y、胆碱乙酰转移酶、一氧化氮合酶等。脊髓钙结合蛋白阳性中间神经元进一步分成PV、Cr、Calb等不同的亚群，因所含GABA递质的量和电生理特性的不同而具有不同的生理作用。形态学研究显示，Calb阳性神经元主要分布于脊髓后角Ⅰ、Ⅱo层、Ⅶ、Ⅷ层内侧部和X层；而PV阳性中间神经元则主要分布于脊髓灰质各种运动核团；Cr阳性神经元在脊髓灰质Ⅱ、Ⅴ-Ⅷ层多见；nNOS阳性神经元除分布于脊髓后角Ⅰ-Ⅲ层之外，还分布于中间外侧柱和中央管周围。综观以往研究，此领域就形态学研究而言，尚不够具体、系列和深入。有关上述中间神经元的分布，尚未见到它们在脊髓不同区域和部位比较性观察的完整系列的研究报道，此便是进行本实验研究的目的之一。有关脊髓灰质中间神经元形态结构，目前可见一些组化、免疫组化、原位分子杂交、甚至电镜超微结构资料，而设计本实验旨在结合脊髓不同部位和区域比较性观察上述阳性中间神经元的形态特征。　　 有关脊髓灰质中间神经元超微结构的实验研究，目前仅见几篇关于脊髓后角浅层的PV、Calb阳性神经元的报道，而且作者也仅仅对阳性产物在细胞内的定位和阳性结构突触连接的性质和形态学特征进行了一般性描述。而脊髓Cr和nNOS中间神经元超微结构的实验研究目前所见甚少。如此有限的电镜超微结构资料极大地限制了对脊髓形态结构、生理机能和病理机制的认识。为此，本实验设计借助于免疫电镜单标记技术观察证实脊髓灰质PV、Cr、Calb、nNOS四类中间神经元的超微结构和突触传入及传出连接特征，为免疫电镜双标记的深入实验奠定基础。　　 业已研究证实脊髓PV、Cr、Calb和nNOS阳性中间神经元涉及到脊髓各种类型的损伤。上述钙结合蛋白相关的神经元在脊髓损伤病理过程中出现不同形式的形态学变化；单侧神经节切除术的实验显示，后角PV阳性纤维明显减少。NO和NOS在中枢神经损伤过程中的作用犹如一柄“双刃剑”，其形态学变化也随损伤的性质、类型、程度和时间不同而异。为了进一步证实脊髓上述4种中间神经元对损伤的敏感特异性反应，本实验设计借助脊神经后根切断模型观察、比较和证实受累脊髓灰质不同区域上述各种相关蛋白的表达和阳性神经元的形态学变化，为深入探讨脊髓中间神经元对损伤反应的病理机制提供形态学依据。　　 材料和方法：　　 1.免疫组化PAP方法证实脊髓中间神经元的特性、形态、数量和分布特征：借助PV、Cr、Calb和nNOS4种抗体进行免疫组化方法探察相应神经元在正常脊髓灰质不同区域和不同部位的形态、数量和分布特征，以及观察证实脊神经后根切断模型中受累脊髓PV、Cr、Calb和nNOS阳性神经元的形态学变化。使用免疫荧光双标记技术观察证实正常脊髓灰质不同区域PV、Cr、Calb和nNOS抗原的相互共存。　　 2.Western Blot免疫印记方法证实正常脊髓灰质Cr、Calb、nNOS的蛋白含量和损伤诱导其变化：探察并比较正常脊髓不同区域和部位上述3种蛋白的表达特征。探察证实损伤诱导受累脊髓灰质Cr、Calb、nNOS蛋白表达的变化。　　 3.免疫电镜观察证实脊髓PV、Cr、Calb阳性神经元的超微结构特征：借助免疫电镜技术探察证实上述3种阳性产物的超微结构定位，阳性结构的突触传入和传出连接的性质和形态学特征。　　 4.动物模型的构建和评价：借助手术显微镜进行腰4脊神经后根切断术构建动物模型，术后动物存活7天。在手术显微镜下切取受累脊髓，并对切片行HE和Nissel组化染色，以证实和评价实验动物模型。　　 结果：　　 1.大鼠脊髓中间神经元形态及其分布特征　　 (1)中间神经元的形态特征及分布规律　　 本实验借助特异性抗体对正常大鼠脊髓灰质4种中间神经元进行免疫组化特异性标记，光镜观察显示，PV阳性神经元在脊髓前角、中间带和后角3个不同区域的形态大小具有统计学差异；即前角最大后角最小，但在颈脊髓、胸脊髓、腰骶脊髓3个部位之间的比较没有明显差异。而PV阳性神经元的数量在3个不同区域的比较结果显示前角明显多于中间带和后角，但在脊髓颈、胸、腰骶3个不同部位之间没有差别。　　 Cr阳性神经元的大小在脊髓不同区域之间的比较有统计学差异，后角明显小于前角和中间带，但在脊髓不同部位之间没有明显差别。Cr阳性神经元的数量在脊髓不同区域的分布有统计学差异，以前角的数量最多中间带最少，而在颈、胸、腰骶脊髓3个不同部位的比较无明显差异。Cr阳性神经元突起的数量和长度随脊髓灰质的区域不同而异；即前角和后角阳性神经元突起的数量和长度较中间带多和长，而在不同部位之间的比较则无统计学意义。　　 Calb阳性神经元的大小在脊髓灰质不同区域之间比较均具有明显统计学意义；即后角胞体明显小于前角和中间带，但在不同部位之间无明显差异。Calb阳性神经元的数量在前角、中间带和后角3个不同区域之间比较结果显示具有明显差异，后角最多、中间带最少，而在脊髓颈、胸、腰骶3个不同部位的分布没有差别。突起的数量在脊髓不同区域和部位之间的比较均无统计学意义。但不同区域突起长度的比较除颈脊髓前角突起长于中间带和后角以外，其余没有统计学差异，不同部位之间突起的长度也无明显差异。　　 nNOS阳性神经元的大小在脊髓灰质不同区域之间有统计学差异，中间带略大于后角，但在脊髓不同部位之间没有差别。神经元数量在中间带和后角2个区域也显示不同，以中间带居多，而不同部位之间的比较没有统计学意义。nNOS神经元突起的数量和长度在脊髓不同区域和部位的比较均无统计学意义。　　 (2)不同类型中间神经元在脊髓不同区域和部位的形态和分布比较：4种阳性中间神经元在脊髓3个不同区域之间的比较结果显示，在前角PV和Cr阳性神经元明显大于Calb神经元，但在中间带Calb和nNOS神经元较大，而后角的大神经元主要为nNOS神经元。但上述4种中间神经元的大小在脊髓不同部位的比较却没有统计学意义。不同中间神经元的数量在脊髓3个不同区域的比较均显示统计学差异；即前角以Cr阳性神经元的数量最多，中间带则以Cr和nNOS阳性神经元数量较多，而后角Cr和Calb阳性神经元的数量多于其它中间神经元。在颈、胸、腰骶脊髓不同部位4种中间神经元的数量比较结果不同；nNOS阳性神经元的数量明显少于其余三种。　　 2.脊髓中间神经元相关蛋白表达和共存关系的实验证实　　 (1)Cr、Calb和nNOS蛋白在正常脊髓不同区域和部位的表达：Western Blot探测显示Cr、Calb和nNOS三种蛋白在脊髓的表达与区域和部位相关。Calb和nNOS在后角的表达均明显高于前角，但Cr在前角和后角的表达则没有统计学差异。Cr、Calb和nNOS三种蛋白分别在脊髓不同部位表达结果显示，除了Calb腰骶脊髓后角明显高于颈和胸脊髓后角以外，其它均无统计学意义。但在脊髓不同区域和部位3种蛋白表达量相互之间存在显著差异；即Cr在3部位的后角明显高表达。　　 (2)脊髓Cr、Calb、PV抗原相互共存关系的实验证实：Cr分别与PV和Calb荧光双标记的结果显示，Cr与PV之间的共存率为1.2％，PV与Cr之间的共存率为5％，而Cr与Calb之间的共存率为7％，Calb与Cr之间的共存率为9％。　　 3.脊髓不同类型中间神经元的超微结构特征：免疫电镜观察结果显示，PV阳性结构为胞体、树突和轴突终末，反应产物散在分布于胞浆内，与细胞器没有明显可辨认的关系。可见大量PV阳性轴突终末与树突或轴突形成抑制性突触连接，同时可见PV阳性胞体和树突接受大量的兴奋性突触传入。Cr和Calb阳性产物主要定位于树突的胞浆内，并可见这些阳性结构接受大量的兴奋性和抑制性突触传入。　　 4.脊髓中间神经元对脊神经后根切断敏感特异性反应的实验证实　　 (1)脊神经损伤诱导中间神经元的形态学变化：如同上述实验借助相应抗体特异性地标记受累脊髓灰质的中间神经元，光镜观察显示PV、Cr和Calb阳性神经元数量与对照组没有明显的统计学差异。但在受累脊髓后角的nNOS阳性神经元数量明显少于对照组。　　 (2)损伤诱导脊髓Cr、Calb和nNOS蛋白表达的变化：借助Western Blot方法检测结果显示，受累脊髓灰质Cr和Calb蛋白表达没有明显变化，但受累脊髓后角nNOS蛋白表达则低于对照组。　　 结论：　　 1.正常大鼠脊髓不同区域和部位的4种中间神经元在形态结构及分布规律方面具有显著的形态学特征，相关蛋白的表达也存在明显差异。不同类型中间神经元相关抗原存在不同的共存率。　　 2.免疫电镜超微结构证实大鼠脊髓灰质PV、Cr和Calb阳性中间神经元接受大量兴奋性和抑制性突触传入，以及与脊髓其它类型神经元主要形成抑制性突触连接，此形态学结果明显提示它们可能牵涉到脊髓微环路调节和神经通路传递的重要机能。　　 3.本实验所探察的脊髓3类钙结合蛋白阳性神经元在神经后根切断损伤因素作用下没有发现明显的形态学变化，结果提示其可能与损伤性质、程度和时间有关。而损伤诱导脊髓后角nNOS阳性神经元负相变化，可能为nNOS阳性中间神经元对损伤的一种特征性的反应形式，提示由nNOS合成的作为重要神经递质的NO对脊神经后根感觉信息的传入具有调节作用。