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目的:利用KLD-12多肽缓释的特性,复合合适剂量的重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2),构建具有生物活性的组织工程支架材料KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶复合骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨该纳米纤维凝胶材料诱导BMSCs成骨活性的实验研究。方法:取3月龄(雌雄不限)新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度法分离并培养BMSCs。取第3代BMSCs分别采用适合浓度的rhBMP-2∕KLD-12多肽体外三维培养(实验组)和KLD-12多肽培养(对照组),诱导BMSCs成骨。培养2、5、7、10、14d细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8)法检测检测两组凝胶内细胞增殖活性;培养7、14d钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)荧光染色观察实验组与对照组凝胶内活细胞与死细胞数量,计算活细胞比率;3、7、10、14、21 d检测两组细胞培养基中碱性磷酸酶(ALP)及骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)含量;培养14 d两组细胞行Ⅰ型胶原免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和骨钙蛋白基因相对表达量。结果:(1)倒置显微镜下观察,培养第7d两组凝胶内的BMSCs呈圆形生长,分布均匀,部分细胞增殖,凝胶边缘BMSCs呈梭形生长,培养第14d凝胶内BMSCs细胞增殖更加明显;(2)CCK-8结果显示:随着培养时间的延长实验组与对照组细胞增殖活性不断增强,第5d实验组与对照组分别为0.631±0.073、0.542±0.061,两组差异有统计学意义(P<0.05),培养14d细胞增殖活性最强,实验组与对照组分别为1.216±0.096、0.860±0.086,两组差异有统计学意义(P<0.05);(3)Calcein-AM/PI荧光染色观察示:培养7d、14d凝胶内均可见圆形活细胞存在,且第14d细胞增殖现象较第7d更明显,可见极少数死细胞,凝胶边缘细胞呈梭形,第14d凝胶内细胞存活率实验组与对照组分别为92.26±2.28%、90.56±3.5%,两组差异无统计学意义(P>0.05);(4)ALP检测结果显示:培养至第7d两组ALP表达量比较,分别为4.05±0.245、3.739±0.113,两组差异有统计学意义(P<0.05),7d~21d实验组ALP表达量均明显高于对照组(P<0.05);(5)OC检测结果显示:培养至第10d起两组OC含量比较,分别为2.764±0.149、2.425±0.167差异有统计学意义(P<0.05),10~21d实验组OC含量均明显高于对照组(P<0.05);(6)培养14d,激光共聚焦显微镜下观察显示:实验组CollagenⅠ免疫荧光染色呈阳性,荧光强度较对照组强。(7)qRT-PCR结果证实,实时荧光定量PCR检测实验组与对照组相比较Ⅰ型胶原相对表达量分别为3.124±0.230、1.001±0.024;骨钙蛋白基因相对表达量分别为2.259±0.167、1.001±0.0167,各比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BMSCs在KLD-12多肽/rhBMP-2内正常生长并快速增殖,KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶诱导BMSCs向成骨细胞分化的生物活性良好。