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骨骼的发育主要是通过膜内成骨和软骨内骨化两种方式,其中四肢骨和躯干骨的生长发育主要通过软骨内骨化方式。该过程起始于间充质细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)的聚集、增殖,继而分化成软骨细胞,然后软骨细胞增殖、成熟、肥大分化为肥大软骨细胞,再经历凋亡、钙化、血管侵入、破骨细胞和成骨祖细胞产生等过程,接着软骨基质降解,骨小梁形成,最终新的骨组织替代肥大化软骨组织,形成新骨。已经有研究者利用体外重演软骨内骨化的方式构建组织工程骨,有望利用软骨内骨化方式更利于血管化的优点来解决骨修复中面临的早期血供缺乏问题。在软骨内骨化的过程中,软骨细胞肥大化改变及终末分化是关键环节,肥大软骨细胞分泌富含X型胶原蛋白的软骨基质,然后终末分化的肥大软骨细胞分泌多种重要因子,高度协调、综合调控,诱导破骨细胞、成骨细胞、血管的侵入。因此,研究软骨细胞肥大化和终末分化的调控机制,对于调节软骨内骨化过程具有重要价值。越来越多证据显示微小RNA(microRNAs,miRNAs)在软骨内骨化过程中发挥着重要的调控作用。课题组前期研究证实miR-145靶向Sox9调控间充质干细胞成软骨分化,但是miR-145在软骨细胞肥大化过程中是否调控相关基因影响软骨内骨化的进程尚不清楚。本课题旨在探究miR-145在软骨内骨化过程中的作用及对骨修复的效果,并分析其通过靶基因之一TNFRSF11B调控软骨细胞肥大化的机制。材料与方法:1.观察刚出生小鼠的股骨发育过程,利用形态学染色、免疫组化方法确定软骨的静止区、增殖区、肥大区,利用荧光原位杂交实验检测miR-145的分布情况。通过对BMSCs来源的软骨细胞过表达miR-145后,进行肥大化诱导,利用RT-qPCR、Western blot技术检测肥大化相关标志基因,观察miR-145对软骨细胞肥大化的作用;以Balb/c小鼠构建股骨骨折模型,观察miR-145在软骨内骨化过程中发挥的作用。2.结合生物信息学网站和双荧光素酶报告基因检测TNFRSF11B与miR-145的结合关系,利用RT-qPCR、Western blot实验检测TNFRSF11B在肥大化软骨细胞的表达变化情况,并对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的软骨细胞进行OPG(osteoclastogenesis inhibitory factor)抑制实验,分别从mRNA和蛋白水平检测了肥大相关标志基因的表达。利用RT-qPCR方法检测芒果苷对BMSCs来源的软骨细胞中miR-145的影响。实验结果:1.形态学结果观察到小鼠股骨生长板三层软骨细胞呈柱状排列,体积增大,分为静止区、增殖区、肥大区,在软骨细胞肥大区,Col10a1、CD31表达增加;荧光原位杂交图像显示miR-145在软骨细胞肥大区表达显著强于静止区和增殖区。2.过表达miR-145后,Col10a1、MMP13、Runx2等肥大相关标志基因在mRNA和蛋白水平均高表达于对照组和抑制组,且Osterix、Col1a1、Vegfa的表达也高于对照组和抑制组(p<0.05);小鼠骨折模型中,HE、Masson染色和免疫组化显示,过表达miR-145实验组能促进软骨基质降解和骨小梁形成,加快新骨形成。免疫荧光显示Vegfa表达高于对照组。结果说明miR-145通过促进软骨细胞肥大化增强软骨内骨化过程,从而促进骨修复。3.双荧光素酶报告基因显示miR-145显著下调TNFRSF11B的luciferase表达,在肥大化软骨细胞中,TNFRSF11B在mRNA和蛋白水平均显著下降(p<0.01);抑制TNFRSF11B表达后,Col10a1、MMP13、Runx2、Vegfa的表达均高于对照组(p<0.05),可见低表达TNFRSF11B能够促进肥大软骨细胞的终末分化。在BMSCs来源的软骨细胞中给药MAG后继续肥大诱导,qPCR结果显示给药组的miR-145表达显著高于对照组(p<0.01),并且TNFRSF11B的mRNA表达显著低于对照组(p<0.05)。结论:本课题通过小鼠骨折模型建立了研究软骨内骨化效果和机制的体系,通过体内外实验证明了miR-145能够促进软骨细胞肥大分化,并在软骨内骨化过程中促进软骨基质降解和骨小梁形成,从而促进新骨形成;在机制上,本研究证明了TNFRSF11B是miR-145的靶点基因,过表达miR-145能够抑制TNFRSF11B的表达,提高Col10a1、MMP13、Runx2、Vegfa等肥大化标志基因的表达水平,促进肥大软骨细胞的终末分化。同时,初步证明了芒果苷能够促进BMSCs来源肥大软骨细胞中miR-145的表达,并降低TNFRSF11B的mRNA水平。仍需要通过进一步的实验,明确芒果苷是如何调控miR-145表达以及TNFRSF11B在软骨细胞肥大化过程中的分子机制和信号通路。