背景及目的:慢性难愈性创面可以被定义为因血管生成、神经支配、细胞迁移等愈合过程中的生理环节受损而引起的创面愈合周期破坏形成的经久难愈的创面。慢性难愈性创面不仅给患者带来生理以及心理上的严重负担,同时也给医疗卫生系统带来巨大压力。在慢性创面治疗管理中,最常见的慢性伤口是下肢溃疡,这些通常是血管或糖尿病性质,占所有下肢伤口的98%。血管新生是组织修复的前提和基础,是创伤修复过程中的重要环节,修复创面的肉芽组织中含有大量的新生血管。中医药对血管新生缺陷性疾病和缺血性疾病的治疗历史悠久,有独特的疗效,重视整体治疗和辨证论治。疮灵液是一种不含汞的纯中药外用药液制剂,由黄蜀葵花、大黄、诃子、红花四味中药组成,具有“消炎解毒、活血生肌、收敛止渗”之功效。我们的前期研究发现疮灵液中的黄蜀葵花总黄酮有促进血管内皮细胞增殖的作用。因此,我们提出科学假说:疮灵液能通过调节新生血管内皮细胞的活性,促进创面中的血管新生,改善创面微环境中的细胞因子平衡,从而改善缺血状态,缩短愈合时间,促进创面愈合。方法:我们的研究工作分为三个部分。在第一部分中,实验一主要为疮灵液对糖尿病大鼠慢性难愈性创面愈合的疗效学观察,分为空白对照组(NC Group)、糖尿病模型组(DM Group)、实验低剂量组(疮灵液含低剂量黄蜀葵花,L-CLY Group)、实验高剂量组(疮灵液含高剂量黄蜀葵花,H-CLY Group)、阳性对照组(贝复济组,PC Group)。以一次性大剂量腹腔注射链脲佐菌素使大鼠随机血糖水平≥16.7 mmol/L(300 mg/dL),并出现多饮多食多尿,精神萎靡,体型消瘦,毛色油腻无光泽等表现,视为糖尿病模型建立成功。在腹腔注射STZ后的14天进行糖尿病大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型的制备。主要疗效学观察指标有造模用药后大鼠一般状态观察、创面愈合面积、创面愈合时间、创面愈合率、伤后生存曲线分析。实验二在实验一疮灵液对糖尿病大鼠慢性难愈性创面愈合的疗效学观察以及前期我们的研究结果的基础上,提出疮灵液可促进糖尿病大鼠慢性难愈性创面血管新生的科学假说。通过H&E染色和Masson染色对各组大鼠不同时间点创面组织的结构、创面愈合过程中炎性细胞、成纤维细胞、胶原以及毛细血管的数量及分布进行观察;同时,采用透射电镜对创面进行超微组织结构观察。我们以被荧光素标记的CD 31、CD 34、α SMA对各组大鼠创面组织的冰冻切片进行细胞免疫荧光染色,目的是为了观察各组创面在愈合过程中血管内皮细胞的数量及分布、新生血管的密度及活跃程度。此外,我们通过免疫组织化学方法、酶联免疫吸附测定法以及Real-time PCR对促血管新生的关键因子血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR2)、下游相关的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)进行了测定与分析。在第二部分的实验中,我们用鸡胚绒毛尿囊膜这一研究血管新生理想的模型为载体,通过观察疮灵液对于尿囊膜血管生长形状、血管数量及密度的影响,进一步证实疮灵液对慢性创面的促血管新生作用。在第三部分实验中,我们基于从第一部分及第二部分实验得到的结果,将侧重点放于疮灵液对于血管内皮细胞及血管新生的影响。以高糖诱导出人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞损伤模型,通过CCK 8化学检测法、光学显微镜镜下观察及以蛋白免疫印迹实验Cleaved Caspase 3的表达,从细胞活力、形态学、凋亡的角度探索了疮灵液对于高糖诱导HUVECs细胞损伤模型的影响。在研究疮灵液与创面愈合过程中血管新生的关系时,我们采用细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验以及管腔形成实验,从内皮细胞迁移、管腔形成的角度加以研究。与第一部分实验相对应,我们同样以细胞免疫荧光及Real-time PCR的方法研究了疮灵液对高糖诱导的HUVEC细胞损伤模型VEGF/VEGFR 2、α SMA的表达。在机制研究方面,以PI3K抑制剂LY 294002对内皮细胞进行干预,以明确PI3K/Akt通路在疮灵液促进内皮细胞血管新生中发挥的作用。结果:1.通过一次性大剂量腹腔注射链脲佐菌素成功建立糖尿病大鼠模型,并在此基础上通过手术切除背部皮肤及皮下结缔组织的方法制作全层皮肤缺损开放性创面模型。腹腔注射STZ后的糖尿病组大鼠(糖尿病模型组、实验低剂量组、实验高剂量组、阳性对照组)尾静脉取血的随机血糖水平均高于16.7 mmol/L且在之后的各个时间点血糖亦维持在较高水平,体重减轻,摄食量及饮水量增加,毛色油腻无光,精神萎靡,易激惹。对创面观察可知,糖尿病模型大鼠的创面愈合情况不及正常大鼠创面组。2.疮灵液可促进糖尿病创面模型大鼠的创面修复,减小创面面积,提高创面愈合率,缩短创面愈合时间。3.在糖尿病大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型造模成功后的药物干预治疗期间,糖尿病各组大鼠血糖未见明显差异,提示疮灵液促进糖尿病创面愈合的作用独立于降糖的作用,而可能是通过改善创面愈合相关的血管生成、细胞迁移等一系列的生理过程有关。4.疮灵液可促进糖尿病慢性创面肉芽组织增生和成熟、成纤维细胞增殖和胶原纤维组织的沉积,组织细胞排列更加紧密有序,提示疮灵液可加快创面愈合进程。5.疮灵液可促进血管内皮细胞及肌成纤维细胞的增殖、微血管的成熟,增加创面中的微血管密度,提示疮灵液可增加糖尿病慢性难愈性创面愈合过程中的血管新生。6.疮灵液可增加糖尿病慢性难愈性创面VEGF、VEGFR及其下游通路中eNOS的表达,提示疮灵液促进高糖所致的慢性难愈性创面的愈合很有可能是通过VEGF/VEGFR,PI3K/Akt信号通路介导。7.以鸡胚绒毛尿囊膜模型作为研究疮灵液对血管新生影响的载体,观察到疮灵液可增加鸡胚绒毛尿囊膜模型血管生成的数量。8.在细胞实验中,使用33mM葡萄糖对HUVECs孵育72小时诱导的HUVECs细胞损伤模型,可见受损的HUVECs细胞活力下降,细胞呈现典型的凋亡形态。9.疮灵液对高糖诱导的HUVECs细胞损伤模型具有保护作用。10.疮灵液可提高受损的HUVECs模型细胞迁移及管腔形成的能力、增加其αSMA、VEGF/VEGFR2的表达,已达到促进血管新生的效应。11.疮灵液可以促进高糖诱导的HUVEC细胞损伤模型PI3K/Akt通路磷酸化的过程,其促进血管新生的作用也可能与PI3K/Akt通路相关。结论:在以糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型、鸡胚绒毛尿囊膜模型及高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型为载体的基础上,我们发现疮灵液能通过调节新生血管内皮细胞的活性,促进创面中的血管新生,改善创面微环境中的细胞因子平衡,从而改善缺血状态,缩短愈合时间,促进创面愈合,其机制可能是通过VEGF/VEGFR 2及PI3K/AKT信号通路介导。