论文部分内容阅读
肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是全世界最常见的恶性肿瘤之一,有着较高的发病率和死亡率。我国是世界上肝癌的高发地区之一,每年新发HCC病例占全世界新发病例数的比例高达42.5%,严重威胁着人民的身体健康。手术切除和肝脏移植是目前治疗肝癌较为有效的方法,但由于肝癌具有恶性程度高、发展迅速、容易复发和转移等特点,肝癌患者中仅有一部分人适合外科手术治疗。绝大部分肝癌患者只能依赖于放疗、化疗及其它的一些姑息疗法。因此深入研究肝癌的病因及发病机理,对于寻找有效的肝癌化学预防及治疗方法无疑具有十分积极的意义。肝癌的发生和发展是一个多因素、多步骤、多基因作用的复杂过程,研究表明,p21(p21WAF1/CIP1)可能通过不同的途径参与了肝癌的发生和发展。p21属于细胞周期抑制因子(CKIs)中的Cip/Kip家族,可以通过抑制细胞周期蛋白/细胞周期依赖性激酶(cyclin/CDK)复合物活性,使细胞周期进程受阻;而且还可以通过抑制细胞增殖核抗原(PCNA)与DNA聚合酶δ(polδ)结合,从而抑制DNA合成。现已确定人的p125亚基是由POLD1基因编码的, POLD1表达受到细胞周期的调控,但其机制尚未明了。癌基因的活化、抑癌基因的失活或突变以及激素调节、信号转导和转录调控等的失调均可作用于细胞周期调控系统而激活细胞进行不正常的DNA复制,最终出现细胞的异常增殖导致肿瘤的发生。鉴于p21在细胞周期调控和DNA复制中所起的重要作用,本研究通过真核表达载体使p21高表达和慢病毒载体靶向沉默p21表达,研究p21表达量变化对肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响,双向验证了p21对细胞周期进程的抑制作用,在肝癌侵袭转移中可能具有的作用,并初步探讨了p21对POLD1基因表达的影响,从而为下一步深入研究肝癌细胞中p21对POLD1基因的表达调控通路打下了坚实的基础。目的:通过真核表达载体使p21高表达和慢病毒载体靶向沉默p21表达对肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响,验证p21对细胞周期进程的影响,在肝癌侵袭转移中是否发挥作用,并初步探讨在肝癌细胞中p21对POLD1基因表达的影响。方法:1.瞬时转染:将表达p21 cDNA的真核表达载体pXJ41-p21及空载体pXJ41-neo转染入SMMC-7721细胞;将p21小干扰RNA片段p21-siRNA、阴性对照片段NC转染入SMMC-7721细胞。2.稳定转染:SMMC-7721细胞瞬时转染pXJ41-p21及空载体pXJ41-neo后,经G418筛选,获得稳定细胞系7721-p21、7721-pXJ;用包装有p21小干扰RNA片段p21-siRNA及阴性对照片段NC的慢病毒载体感染SMMC-7721细胞,经有限稀释法获得稳定细胞系7721-p21RNAi、7721-NC。3. RT-PCR、Western-blot检测瞬时转染及稳定转染后p21、POLD1的mRNA和蛋白表达水平。4.通过生长曲线测定,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,克隆形成实验,侵袭和迁移能力测定,了解SMMC-7721细胞在p21表达水平改变后生物学行为的变化。结果:1.瞬时转染p21 48h后发现,p21 mRNA表达水平升高, POLD1 mRNA表达水平降低,并且SMMC-7721细胞生长速率下降,G0/G1期占细胞周期比例升高,S期比例下降(P<0.05)。对高表达p21的稳定细胞株研究发现,随着p21 mRNA及蛋白表达水平升高, POLD1 mRNA及蛋白表达水平随之降低;细胞生长受抑制,G0/G1期比例升高,细胞凋亡比例及克隆形成数减少,迁移及侵袭能力减弱。2.瞬时转染p21小干扰RNA片段48h后发现,p21 mRNA表达水平降低, POLD1 mRNA表达水平升高,并且SMMC-7721细胞生长速率升高,G0/G1期占细胞周期比例下降,S期比例升高(P<0.05)。对p21低表达的细胞株研究发现,随着p21 mRNA及蛋白表达水平下降, POLD1 mRNA及蛋白表达水平随之增强;细胞生长速度加快,G0/G1期比例下降,S期比例升高,细胞凋亡比例及克隆形成数增多,迁移及侵袭能力增强。结论:p21可以抑制SMMC-7721细胞的细胞周期进程,对抗凋亡的发生,有可能参与了肝癌的侵袭转移的发生。POLD1基因的表达水平与p21呈负相关,p21可能参与了POLD1基因的调控,并且这种作用有可能是p21对细胞增殖抑制及细胞恶性表型变化的调控途径之一。