【研究背景】胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumor,GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤,其生物学行为和临床表现可以从良性至恶性。GIST肿瘤危险度评估多根据肿瘤发生部位、大小、核分裂象计数以及肿瘤是否破裂,良恶性GIST的分子生物学特征仍不明确。大多数恶性GIST表现为多结节或单个结节内均一的高级别病理组织形态,但有少数病例表现为结节内高低级别组织形态共存或多结节病变中部分结节为高级别部分为低级别。因而,恶性GIST是初始发生即为恶性,还是由已存在的低侵袭性肿瘤进展而来还存在争议。目前,已有基于不同个体的基因突变检测和基因表达分析显示高危GIST较低危肿瘤具有不同的基因突变和蛋白表达,但多病例同一患者原发性低级别GIST向高级别转化的分子机制研究未见报道。【目的】本研究拟首先从组织学水平阐述GIST原发性高级别转化的形态学和免疫组化表达改变,进而在分子水平采用全外显子测序检测高级别肿瘤较低级别肿瘤的差异性基因改变,并进一步探讨和验证其可能的分子机制,为GIST准确预后分级提供新的依据,有望阐述部分恶性GIST发生机制,为恶性GIST治疗提供理论基础和指导。本研究目的主要包括:1.比较高低级别共存GIST肿瘤中两种成分的形态学差异及免疫组化表达差异;2.比较GIST高级别较低级别成分差异性基因突变,分析基因突变可能产生的功能,并进一步探讨其促进GIST高级别转化的可能分子机制;3.分析全外显子测序数据中MYC拷贝数变异,检测多量GIST样本中MYC基因拷贝数变异,探讨MYC拷贝数变异促进GIST高级别进展的分子机制;4.细胞功能实验检测MGA在GIST细胞增殖中的功能,并初步探讨其抑制细胞增殖的相关分子机制;5.探讨细胞周期调控因子CyclinD1和p16INK4A在GIST中的表达,及其在肿瘤进展中的功能。【方法】本研究采用了组织病理学、免疫组织化学、高通量测序、荧光原位杂交(FISH)以及分子生物学实验等研究方法,主要列举如下:1.回顾性分析22例高低级别共存GIST病例临床病理特征,比较两种成分的形态学和免疫组化表达差异,并随访患者预后;2.10对高级别和低级别肿瘤样本行全外显子测序,比较高级别GIST较配对低级别肿瘤差异性基因突变及基因拷贝数变异;3.Sanger测序验证高级别较低级别差异性肿瘤驱动基因突变;FISH验证基因拷贝数变异,并用于大样本检测目的基因拷贝数变异;4.应用WesternBlot检测GIST细胞系中MGA、MAX、MYC、p16INK4A和CyclinD1的蛋白表达水平;5.应用shRNA慢病毒感染技术构建MGA低表达GIST细胞系;6.利用细胞生长曲线和平板克隆形成实验检测GIST细胞系的细胞增殖能力;7.免疫组化染色检测GIST肿瘤中CyclinD1和p16INK4A表达。【结果】1.22例高低级别肿瘤成分共存的GIST患者术前均未接受酪氨酸激酶抑制剂治疗,肿瘤多发生于小肠(16例)和胃(5例),直径均≥4cm,9例表现为多灶性病变,6例发生转移,1例术后半年复发,4例术后4年内死亡。低级别肿瘤成分细胞密度低,细胞呈梭形,形态温和,核分裂象少见,1~2个/50高倍视野(HPF);高级别成分细胞排列紧密,呈短梭形或上皮样,异型性明显,核分裂象多见,6~90个/50HPF。高级别肿瘤较低级别肿瘤CD34表达明显减少,两种成分Ki-67增殖指数有明显差异。2.与人参考基因组GRCh37/hg19比对,20例样本全外显子测序结果共检测到247个肿瘤驱动基因的802个位点突变;其中193个(78.14%)突变基因同时发生在GIST高级别和低级别成分中,另外,30个(12.15%)突变基因只出现在高级别肿瘤,24个(9.71%)突变基因仅出现在低级别肿瘤。3.10对GIST肿瘤样本的全外显子测序中,每例患者肿瘤高低级别成分均具有相同的KIT基因突变。4.全外显子测序检测到30个肿瘤驱动基因的35个突变仅发生在GIST高级别成分;Sanger测序证实9个基因的突变仅发生在高级别肿瘤,包括MGA、SDHA、ARID1A、LATS2、MAX、SETD2、RB1、RPS6KB2和PIK3CA,其中MGA突变在2个病例中被检测到。KEGGpathway分析提示这些差异性突变的基因主要参与细胞周期调控、凋亡抑制和染色体重塑等相关的通路。5.比对cBioPortal数据库,RB1、MAX、SETD2、SDHA、ARID1A、MGA和PIK3CA均为可重复性突变,前6个均为GIST前20位常见突变基因;基因LATS2和RPS6KB2突变首次在GIST中报道。6.全外显子测序基因拷贝数分析发现3例患者高级别肿瘤较低级别肿瘤MYC基因拷贝数增加;FISH证实1例患者高级别肿瘤MYC拷贝数扩增,另外2例高低级别成分均为8号染色体多体伴有MYC拷贝数增加。7.分子生物学实验发现MGAshRNA慢病毒感染GIST细胞系较正常和阴性对照细胞系p16INK4A表达降低,CyclinD1表达升高,MAX和MYC表达无明显差异;MGAshRNA稳定感染GIST细胞具有较强的增殖活性和克隆形成能力。8.p16INK4A在高级别GIST肿瘤组织表达减少,其表达与核分裂象计数、Ki-67增殖指数、肿瘤危险度分级以及肿瘤最大直径呈负相关;CyclinD1在高级别肿瘤组织高表达,其表达与核分裂象计数和肿瘤最大直径呈正相关。9.130例GIST样本中50.77%的样本发生MYC基因低拷贝数增加;高低级别共存GIST中高级别成分较低级别成分MYC拷贝数增加明显,单纯性病例高级别肿瘤较低级别肿瘤MYC拷贝数增加发生率增高;高低级别共存GIST低级别肿瘤MYC拷贝数增加的发生率明显高于单纯性低级别肿瘤;在单纯性高级别或低级别GIST,MYC拷贝数增加与核分裂象计数和Ki-67增殖指数呈正相关,与p16INK4A表达呈负相关。【结论】1.高级别和低级别成分共存的GIST肿瘤多发生在小肠,易发生转移,患者预后较差。与低级别肿瘤成分相比,高级别肿瘤细胞密度高,呈短梭形或上皮样,异型性明显,可见坏死,核分裂象更多见,Ki-67增殖指数增高,CD34表达降低。2.全外显子测序数据显示高低级别共存GIST病例中两种成分的基因突变多数相同,包括KIT突变,提示两者可能起源于共同的祖细胞,随着肿瘤生长发生一些差异性的突变,从而形成了高级别和低级别肿瘤的异质性。3.仅发生在高级别GIST的差异性突变可能是肿瘤进展中的原发性分子事件。GIST肿瘤进展可能是多个基因通过不同的细胞信号通路分别或协同作用的结果,尤其是细胞周期调控相关基因突变可能通过调控细胞周期促进肿瘤细胞增殖,进而导致GIST由低级别向高级别转化。4.MGA/MAX/MYC网络可能在GIST肿瘤进展中发挥了重要作用。MGA表达下调促进GIST细胞生长和细胞克隆形成,可能是通过p16INK4A/CDK4/CyclinD1细胞周期调控通路实现。5.MYC拷贝数增加在GIST是一种常见的基因改变,可能在肿瘤早期即发生;伴有MYC拷贝数增加的低级别肿瘤更可能进展为高级别,MYC拷贝数增加的GIST具有更高的增殖活性,其机制可能是通过p16INK4A调控细胞周期实现的。6.p16INK4A表达减少和CyclinD1表达增高可能通过促进肿瘤细胞增生导致GIST由低级别肿瘤向高级别肿瘤进展。总之,高级别和低级别GIST具有较为显著的形态学和免疫组化表达差异,GIST肿瘤原发性进展可能是多种基因通过不同通路分别或协同作用的结果,其中细胞周期调控相关基因突变、MYC基因拷贝数增加以及细胞周期调控因子表达改变在GIST肿瘤原发性进展中起了重要的作用。