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microRNAs（miRNAs）是一类长约22 nt的内源性非编码单链RNA,广泛存在于真核细胞中,在进化上高度保守,主要通过与靶基因的3′UTR结合,在转录水平抑制或降解靶基因的表达,从而参与调控细胞的多种生物学过程,如增殖、凋亡、分化、自噬和迁移等。本研究基于课题组前期研究基础,即利用高通量测序技术从沙子岭猪不同发育阶段的睾丸组织中鉴定出374种miRNA,并通过高内涵筛选技术筛选出了60个促进猪未成熟支持细胞增殖的miRNA,从中选取miR-191作为研究对象。采用双荧光素酶报告基因实验、流式细胞术、CCK-8试剂检测、Ed U染色、实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）、ATP水平检测以及Western Blot等多种分子实验技术手段,初步解析了miR-191靶向BDNF基因通过激活PI3K/AKT信号通路调控猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的机理。研究结果如下:1、将miR-191 mimic/mimic NC及miR-191 inhibitor/inhibitor NC分别转染至猪未成熟支持细胞中,利用流式细胞术、CCK-8、Ed U、RT-q PCR、ATP水平测定和Western Blot技术检测了细胞增殖和凋亡情况。实验结果显示,过表达miR-191促进细胞的周期进程,增强细胞增殖活性,降低细胞的凋亡率,提高细胞内ATP的表达。抑制表达miR-191的结果与之相反。结果表明,miR-191能够促进猪未成熟支持细胞的增殖而抑制其凋亡。2、利用miRwalk、Target Scan和miRanda三款在线软件预测了不同物种中miR-191的靶基因,根据结合位点保守性分析,筛选出BDNF基因作为miR-191的候选靶基因,并进一步构建BDNF-WT和BDNF-MUT双荧光素酶报告基因载体,并与miR-191mimic/mimic NC两两组合共转染后,检测荧光素酶活性。结果显示,miR-191能靶向结合BDNF基因的3′UTR位点。将BDNF si RNA和si RNA NC分别转染至猪未成熟支持细胞中,采用流式细胞术、CCK-8、Ed U、RT-q PCR、ATP水平检测及Western Blot技术检测细胞的增殖和凋亡情况。结果发现,与对照组相比,转染BDNF si RNA后,细胞周期进程加快,处于增殖期的细胞比率增加,细胞凋亡率降低,细胞内ATP含量升高。上述结果表明,靶基因BDNF抑制猪未成熟支持细胞的增殖而促进其凋亡。3、分别将miR-191 inhibitor+BDNF siRNA、miR-191 inhibitor+si RNA NC和inhibitor NC+si RNA NC三组共转染试剂转染至猪未成熟支持细胞中,采用上述多种分子实验技术检测其对未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响。结果显示,相较于对照组,转染miR-191 inhibitor+BDNF si RNA后,处于增殖期的细胞比例显著升高（P＜0.05）,增殖相关基因PCNA、FGF2、GDNF、BMP4和EGF的m RNA表达水平升高,细胞内ATP的表达水平也显著提高,而促凋亡相关基因BAX和Caspase-3的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,抑凋亡标志基因Bcl2的蛋白表达水平极显著升高（P＜0.01）。转染miR-191 inhibitor+si RNA NC组的结果与转染miR-191 inhibitor+BDNF si RNA结果相反。为探究miR-191靶向BDNF基因调控细胞生长的分子机理,采用Western Blot技术对不同处理后PI3K/AKT信号通路中关键基因的蛋白表达水平进行了检测。实验结果表明,相较于对照组,过表达miR-191后,极显著的促进了猪未成熟支持细胞内PI3K和AKT的磷酸化水平（P＜0.01）,抑制表达miR-191后,结果与之相反;转染BDNF si RNA后,相较于si RNA NC组,细胞内PI3K和AKT的磷酸化水平均极显著提高（P＜0.01）;在共转染处理组中,相较于对照组,转染miR-191 inhibitor+BDNF si RNA后细胞内PI3K和AKT的磷酸化水平显著提高（P＜0.05）。上述结果表明,miR-191调控猪未成熟支持细胞的生长机理是通过靶向BDNF基因并激活PI3K/AKT信号通路实现的。综上所述,miR-191靶向BDNF基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖,而抑制其凋亡。