牛奶来源外泌体miRNA和circRNA在金黄色葡萄球菌源乳腺炎中的功能研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xinshouji1
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
致病菌感染是威胁人类健康的主要原因之一,全球范围内每年因致病菌感染而死亡的人数超过1500万。金黄色葡萄球菌是社区和医院相关感染的主要致病菌,严重威害人类健康并造成巨大经济损失。在农业生产中,由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中最常见的病症之一,不仅会导致奶牛泌乳量下降,还会导致牛奶品质发生变化,进而造成乳制品产业的重大损失。因此,遏制金葡菌感染对于畜牧生产和人类健康具有重要意义。外泌体是一种由细胞分泌的直径约为100nm的囊泡,广泛存在于包括牛奶在内的各种体液中。外泌体中含有大量具有生物功能的内容物(如蛋白、脂质和核酸等),这些内容物可以通过外泌体的内在化进入受体细胞,从而调控相关生理生化过程。同时,外泌体内容物成分和数量的变化也能够反映出供体细胞的不同生理状况,指示出供体细胞的生理生化变化。但在由致病菌感染引起的相关疾病中,关于外泌体功能的研究尚不明确,尤其是关于外泌体中具有生物学功能的非编码RNA在致病菌感染过程中发挥怎样作用的研究不够深入。因此,本试验以我国西北地区泌乳中期荷斯坦奶牛的牛奶来源外泌体为研究对象,以金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎为模型,探索致病菌感染过程中外泌体内miRNA和circRNA等非编码RNA发挥的免疫调节功能。为了验证金黄色葡萄球菌感染导致奶牛乳腺炎的普遍性,本试验从西北地区76头奶牛的301个牛奶样品中检测到有24头奶牛、42个奶样受到金黄色葡萄球菌感染,检出率分别为31.58%和13.95%。然后,采用超速离心的方法从选出的3个对照组(健康奶样)牛奶样品和6个感染组(金葡菌感染)牛奶样品中分离外泌体,用透射电子显微镜、动态光散射和流式细胞仪对外泌体进行检测,结果表明牛奶来源外泌体的平均颗粒直径为119.4nm,外泌体表面分子标志物CD63和CD81的阳性率分别为72.0%和77.9%,证实我们的研究对象的确是牛奶来源外泌体。接下来本研究探究了牛奶来源外泌体中miRNA在响应金葡菌感染过程中的功能。对牛奶来源外泌体中总RNA进行提取后,利用二代测序的方法检测miRNA的表达量。从牛奶来源外泌体中共获得290种miRNA,其中有221种是已知的miRNA,另外69种为新发现的miRNA。在这些miRNA中表达量最高的为bta-mi R-148a。牛奶来源外泌体中发现的已知miRNA在30对奶牛染色体上均有分布,分布最广泛的为奶牛染色体Chr X、Chr 19和Chr 21。与对照组相比,感染组牛奶样品外泌体中有37种miRNA表达量显著改变,28种表达量显著上调,9种显著下调。这些结果说明,金黄色葡萄球菌感染会导致牛奶来源外泌体中miRNA表达量发生改变。对表达量有显著差异的miRNA的靶基因进行预测并对其进行GO和KEGG分析,结果表明靶基因富集在121个GO通路中,而与免疫相关的“溶酶体通路(lysosome pathway)”是富集程度最显著的KEGG通路。为了探索牛奶来源外泌体中可以代表金葡菌感染的关键miRNA分子,本研究以实际表达量和表达量变化倍数为标准对外泌体中的miRNA进行了筛选,结果表明bta-mi R-378和bta-mi R-185具备成为金黄色葡萄球菌源乳腺炎的牛奶来源外泌体中的关键miRNA的潜能。为了进一步研究bta-mi R-378和bta-mi R-185的生物学功能,通过生物信息学方法预测了它们的靶基因,并且用双荧光素酶报告载体进行了检测,结果表明VAT1L是bta-mi R-378的靶基因;DYRK1B、MLLT3、HP1BP3、NPR2和PGM1是bta-mi R-185的靶基因。虽然已有研究表明外泌体中含有circRNA,但是关于牛奶来源外泌体中circRNA的研究未见报道。本研究首次证实,牛奶来源外泌体中存在表达量丰富的circRNA,且金黄色葡萄球菌感染会显著下调牛奶来源外泌体中circRNA的总量,但同时会增加circRNA的丰度。牛奶来源外泌体中circRNA的长度范围跨度很大,在奶牛30对染色体上均有分布,1号染色体上分布的circRNA种类最多(2258种)。金黄色葡萄球菌感染导致牛奶来源外泌体中290种circRNA表达量发生显著变化,其中表达量显著下调的有169种,显著上调的有121种。通过对这些circRNA的原始基因进行GO分析和KEGG分析,发现表达量有显著变化的circRNA的原始基因很多富集在与免疫相关的通路中。此外,由于circRNA具有做为miRNA的“分子海绵”的功能,所以对表达量上调倍数最高的8种circRNA能吸附的miRNA进行了分析,并且分析了这些miRNA的靶基因,发现多种靶基因与免疫相关。为了进一步探索外泌体中的circRNA在机体抵抗致病菌感染过程中发挥的作用,本研究从测序数据中筛选得到了三类circRNA(表达量上调程度最大的8种circRNA、表达量下调程度最大的6种circRNA以及表达量无显著变化的8种circRNA),利用特异性引物PCR扩增、RNase R抗性等方法对这22种circRNA进行了确认。然后,为了研究circRNA包装进入外泌体的机制,对牛奶来源体细胞和外泌体中circRNA以及线性同源基因的相对表达量进行了比对,结果表明circRNA是通过选择性包装机制进入外泌体中的,并且金黄色葡萄球菌入侵会改变包装进入外泌体中的circRNA的种类。综上所述,本试验以金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎为模型,研究外泌体中miRNA和circRNA在机体抵抗致病菌入侵过程中的作用,试验结果表明机体可以通过主动调节有功能的非编码RNA向外泌体中的分泌来抵抗致病菌的感染,并且这种主动调节有可能会通过牛奶等介质实现跨世代间甚至跨物种间的调节,这对认识以乳腺炎为代表的细菌感染引发的疾病提供了新的理论基础。
其他文献
以节能降耗为目标,对煤矿井下排水设计进行了探讨,确定最佳的计算流量,保证设计方案的经济性。
企业集团化是我国煤炭企业发展的必然趋势,煤炭企业集团公司组建后,面临的环境发生了变化,因此,必须重新对煤炭销售管理体制进行设计与选择。按组织结构设置与权责划分的不同
2009年5月,温家宝总理参观了中国下一代互联网CNGI—CERNET2/61X.指出,下一代互联网是发展科技的一个重要方戚.发展科技的关键在于自主创新.必须把理论研究,技术创新结合起来。
高校的信息化建设在教育信息化中扮演着重要角色。《国家中长期教育改革和发展规划纲要(2010—2020年)》明确提出要加快教育信息化进程,把教育信息化纳入国家信息化发展整体战略
马钢与英国BOC公司共同出资成立的马鞍山马钢比欧西气体有限公司两台4万m^3/h制氧机组于近期相继建成投产。
江西省2011年1月正式启动高校数字图书馆建设项目,以服务于全省86所普通高校。项目建设的主要内容为改造中心机房、建立文献资源和公共服务平台。其中,中心机房将在江西师范大
介绍了可编程控制器在工业控制领域的应用,在应用过程中,表现出了可靠性强、适用性强、易学易用的强大优势,但是要保证PLC系统在工厂环境下正常运行,还应该注意干扰等一系列细节
各工业企业用电系统功率因数的高低,直接影响整个电网的供电质量和电力系统的电能利用率。文章分析了无功补偿的作用和补偿容量的选择方法,说明采用无功补偿技术,提高用电设备的
【正】 应邵阳市东区农家乐化工厂的邀请,以烟茎、烟筋和卷烟厂的下脚料烟草粉末为原料研制蔬莱、水果和茶叶等作物的高效低毒杀虫剂——烟碱复合杀虫剂。经过一年多的研制和
合并会计报表是以母公司和子公司组成的企业集团为会计主体,综合反映企业集团整体财务状况、经营成果及现金流量的会计报表。由于其所提供会计信息的特殊性,约束了合并会计报表