蛹虫草铜锌超氧化物歧化酶的研究

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蛹虫草是一种昆虫寄生真菌,在生物控制中起到重要的作用。在其定植于寄主体内的过程中,遇到的首要问题是寄主的高活性氧的阻遏反应。真菌建立了许多保护机制来消除活性氧危害,超氧化物歧化酶即为抗氧酶中的一种。 研究了Cu2+、Zn2+对蛹虫草菌丝体抗氧酶活性及脂质过氧化水平的影响。结果表明:高浓度的Cu2+抑制菌丝体的生长和细胞内抗氧酶的活性;高浓度的Zn2+对菌丝体的生长也有抑制作用但抗氧酶的活性变化对其不敏感。细胞内抗氧酶的活力随培养时间表现出两头高中间低的变化趋势,脂质过氧化水平随之变动。蛹虫草菌丝体对Cu2+、Zn2+有较高的耐受度。 从蛹虫草菌丝体中获得了cm-SOD的cDNA基因克隆,以质粒pET-21a(+)为载体,在大肠杆菌中获得了可溶性表达。重组蛋白经过以下三步得到纯化:DEAE-FF阴离子交换柱;CM-52阳离子交换柱;SephadexG-100,比活27272.7U/mgprotein,纯化倍数6.1倍,产率85.0%。毛细管电泳分析其纯度为94%。重组蛋白的分子量15407Da,等电点7.0,对H2O2及KCN敏感,在pH7.8,50℃下水浴4小时酶活剩余80±2%。 重组大肠杆菌在LB培养基中过量表达的重组蛋白多数以apo-cm-SOD的形式存在。蛋白经过DEAE-FF阴离子交换柱和CM-52阳离子交换柱可以达到电泳纯。在pH6.0含apo-cm-SOD的磷酸缓冲液中添加Cu2+、Zn2+可以重新构建具有酶活力的蛋白。
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