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肝纤维化是多种慢性致病因素作用于肝脏引起ECM过量沉积的创伤愈合过程，激活的HSC是产生ECM的主要来源细胞。HSC活化是肝纤维化发生的中心环节。因此针对HSC的抗肝纤维化治疗成为治疗肝纤维化的关键步骤。目前针对肝纤维化的治疗主要集中于抑制HSC活化及胶原合成、促进胶原降解等几方面。目前研究发现DNA甲基化在HSC活化过程中具有重要作用。为了进一步探讨DNA甲基化在肝纤维化中的作用机制，我们应用5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycitydine,5-AzadC）作用于HSC，研究其对HSC活化增殖的影响及其分子机制，以揭示更多干预HSC活化的作用靶点。研究主要是从DNA甲基化这个角度进行，以重要的促HSC活化的细胞因子PDGF介导的信号转导通路为对象，以期为临床防治肝纤维化提供新方法、新思路。研究内容主要包括以下三个部分：1. RASAL1在大鼠肝纤维化中的表达变化CCl4皮下注射建立大鼠肝纤维化模型，正常组10只、CCl4处理组（3、6、9、12W）各15只。自处理之日开始，除正常组，其他各组雄性大鼠皮下注射50%CCl4植物油溶液（1ml/kg）每周2次，共12周；正常组给予同样剂量花生油皮下注射。12周末，取肝组织进行病理组织学和Masson胶原染色检测，并检测RASAL1在大鼠肝组织中的表达变化。实验结果表明，大鼠肝纤维化模型建立成功。在肝纤维化形成过程中RASAL1表达逐渐降低。2. DNA甲基化抑制剂和MeCP2对HSC-T6细胞活化增殖的影响应用DNA甲基化抑制剂和RNA干扰沉默甲基CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein2，MeCP2）以观察对大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞增殖的影响。体外培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6，PDGF-BB10ng/ml刺激细胞24h后，加入不同浓度的5-AzadC温育48h，MTT法检测5-AzadC对HSC增殖的影响，RT-PCR方法测定各组α-SMA，CollagenⅠ的mRNA表达水平；同时应用免疫印迹，免疫组化检测肝组织MeCP2，α-SMA蛋白的表达。根据MeCP2的碱基序列设计并合成小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA），通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内，荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测HSC-T6细胞增殖变化；Quantitative Real-Time PCR检测α-SMA、MeCP2mRNA的表达；流式细胞术检测HSC-T6细胞周期的变化；Western Blot检测α-SMA、MeCP2蛋白的表达。将MeCP2-siRNA转染进HSC-T6细胞内，MeCP2基因及蛋白水平明显降低；同时α-SMA基因与蛋白的表达水平亦明显降低；靶向封闭MeCP2基因的表达可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖。实验结果表明，DNA甲基化和MeCP2可能是潜在的治疗肝纤维化的治疗靶点。3. MeCP2对RASAL1表达的调控作用研究。肝星状细胞（HSC）活化转化成肌成纤维化母细胞，分泌ECM是肝纤维化发生的中心环节。前期研究发现，应用DNA甲基化抑制剂5-AzadC处理肝星状细胞可阻止其活化增殖，并可促进Ras-GTP酶激活样蛋白1在肝星状细胞中的表达。文献报道，RASAL1甲基化与成纤维细胞活化及肝纤维化的形成密切相关。我们推测，DNA甲基化促进肝纤维化与RASAL1启动子发生甲基化，导致其表达下降有关。为了寻找潜在的分子机制，利用小干扰RNA沉默MeCP2，发现可以提高RASAL1基因和蛋白的表达水平，表明RASAL1发生甲基化与MeCP2有关。以上研究发现表明， MeCP2作为DNA甲基化重要的结合蛋白，可能成为纤维化防治的潜在作用靶点。