蔗糖水解酶根据其作用基侧的不同可以分为α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）和β-呋喃果糖苷酶（EC 3.2.1.26,β-fructofuranosidase,β-FFase）。其中,α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物中,而β-FFase在动物体内很少存在。BmSuc1是家蚕（Bombyx mori）β-FFase编码基因,也是第一个获克隆鉴定的动物型β-FFase基因。桑叶的乳汁中含有高浓度的糖类似生物碱如DNJ、D-AB1等,它们是α-葡萄糖苷酶的强烈抑制剂,对非食桑昆虫具有很强的毒害作用,但是对β-FFase却没有抑制作用。家蚕是专一以桑叶为食的鳞翅目昆虫。本实验室的前期研究结果表明,BmSUC1在家蚕从桑叶中吸收蔗糖营养,满足幼虫正常生长发育的生理过程发挥重要作用。BmSuc1具有在家蚕幼虫的中肠和前中部丝腺表达的组织特异性。虽然继BmSuc1之后,少数几种昆虫的β-FFase基因被鉴定,但到目前为止,关于此类新发现的动物基因的转录调控机制方面的知识极为匮乏。本研究构建了BmSuc1启动子区域的缺失片段,利用双荧光素酶报告系统对关键启动子区域进行了研究。同时对关键启动子区域的潜在转录调节因子及其对BmSuc1转录表达的调控作用进行了分析。获得的主要研究结果如下:1)我们首先克隆获得BmSuc1上游约2 kb的启动子片段,构建不同截短片段的荧光素酶重组报告载体,转染至家蚕BmN细胞,测定荧光素酶活性。最终发现BmSuc1的启动子序列上存在着四段关键区域,分别为-1911 bp到-1820 bp、-1038 bp到-897 bp、-565 bp到-450 bp以及-248 bp到-9 bp,这些区域的缺失严重影响了 BmSuc1的转录活性。2)通过对关键启动子区域转录因子的预测与分析,我们克隆得到TATA box-binding protein 基因BmTBP。RT-PCR 和 qRT-PCR 的结果表明BmTBP在BmSuc1高量表达的两个组织,中肠和丝腺中也存在较高的表达水平,且BmTBP和BmSuc1在幼虫中肠组织的表达模式十分类似,说明BmTBP可能参与BmSuc1的转录调控。3)为了后续研究,我们对BmTBP进行了原核表达以及重组蛋白的纯化并制备了免疫兔多克隆抗体。根据BmTBP的ORF,我们设计了多条siRNA,并转染BmN细胞,其中61siRNA无论是在转录水平上还是蛋白水平上都能够显著的降低BmTBP在细胞中的表达。随着BmTBP表达量的降低,BmSUC1的表达也明显下降。而在RNAi-BmSuc1转基因品系家蚕的中肠和丝腺中,BmTBP的表达均不受干涉BmSuc1表达的影响。这表明BmTBP很可能是BmSuc1表达的上游调控因子。4)根据BmSuc1上游TATA顺式作用元件（cis-regulatory element,CRE）区域的核苷酸序列,设计生物素标记的探针,利用原核表达纯化的BmTBP重组蛋白,进行凝胶阻滞实验,结果发现BmTBP在体外能够和TATA CRE探针特异结合。同时在过表达BmTBP的BmN细胞中进行染色质免疫沉淀实验,发现BmTBP在细胞中也能够和TATA CRE相互结合。这些结果再次表明BmTBP能够作为上游调控子,结合在BmSuc1启动子区域的TATACRE,从而调控其表达。5)利用蛋白质互作等生物信息学在线分析工具,我们找到了另外一个可能和BmTBP相互作用,并参与BmSuc1转录调控的转录因子:small subunit of transcription factor TFIIA（BmTfIIA-S）。RT-PCR和qRT-PCR结果表明BmTfIIA-S在中肠组织有着高水平的表达。利用纯化的BmTBP和BmTfIIA-S重组蛋白进行far western blot实验,发现二者在体外能够相互结合。构建BmTBP和BmTfIIA-S两个基因的荧光素酶报告载体,共转染至BmN细胞,发现BmSuc1的启动子活性显著增强。这些结果表明BmTBP能够和BmTfIIA-S相互结合,共同调控BmSuc1的转录表达。6)我们初步探究了BmSuc1在家蚕丝蛋白基因表达调控中的可能作用。发现该基因与丝腺特异转录因子SGF1和SGF3表达量上存在一种相互协调的作用,而干涉BmSuc1的表达与否却并不影响受SGF1和SGF3调控的丝胶蛋白基因1（Ser1）的转录水平。结合实验室的其他数据,我们推测BmSuc1在丝腺的高量表达可能影响了 Ser1蛋白的翻译后糖基化修饰。至于如何修饰以及BmSuc1与SGF1、SGF3之间在表达上呈现的这种相互协调关系的生物学意义仍需进一步研究确定。