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研究目的及背景肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝癌中的一种类型,是常见的恶性肿瘤[1],其生物学行为较为恶性,但由于肝脏较强的代偿能力,在疾病早期并没有显著的症状,发现时肿瘤常常已经处于进展期,由于根治性手术治疗,包括肝移植和肝肿瘤切除术或射频消融只适用于部分早期患者[2],中晚期患者缺乏有效的治疗手段,故HCC的死亡率居各类肿瘤死亡率的前列。在我国,肝细胞癌多继发于乙型肝炎病毒感染,丙型肝炎所致的肝细胞癌近年来比例有所增加。据报道[3],对于患有病毒性肝炎的病人,其HCC的发病率是正常人群的20倍。失去手术机会的肝癌病人缺乏有效的治疗手段,化疗药物对于进展期HCC的作用并不十分理想。索拉菲尼是一类新型靶向治疗HCC的药物[4],其通过抑制RAF-1、B-RAF的丝/苏氨酸激酶活性直接抑制肿瘤生长,并且通过FLT-3、VGFR-2、VEGF-3、PDGF-β、KIT等多种受体的酪氨酸激酶活性来抑制肿瘤内血管生长从而间接达到抑制肿瘤的目的[9]。但无论是索拉菲尼或化疗药物,HCC的耐药性一直是阻碍其疗效的重要因素,许多文献报道HCC对于药物的耐药性与肿瘤干细胞息息相关。例如Ep CAM阳性的肿瘤干细胞可以介导HCC对于索拉菲尼的耐药,Oct4阳性的HCC细胞可以产生对多柔比星的耐药[5、6]。在HCC中肿瘤干细胞的标志有许多,包括Ep CAM,CD90,CD133,Oct4,Nanog等,Sox9近年来亦被认为是HCC中肿瘤干细胞的标志之一,Sox9基因最初被发现参与性别形成步骤、躯干的发育及器官的成熟[7],并且最近亦被发现其表达在多种肿瘤中升高。Sox9表达阳性的细胞显示出肿瘤干细胞的特性,其促进肿瘤的增殖,并且增强细胞上皮-间质转化,促进癌细胞转移,并可促进肝癌干细胞自我更新[12]。此外Sox9通过Wnt、Notch、TGF-β通路影响肿瘤的发生及分化[13],通过Notch通路及Numb蛋白促进肝癌干细胞自我更新及增殖[8]。研究发现,癌组织高表达Sox9的肝癌患者预后更差[11]。故在此,我们希望探索Sox9是否参与HCC对索拉菲尼耐药的过程,并且探索Sox9调控HCC对索拉菲尼耐药的具体生物学机制,从而为解决HCC对索拉菲尼耐药提供潜在的方法,丰富进展期HCC治疗的手段,从而改善一部分临床患者的预后。研究方法与结果第一部分探讨肝细胞癌细胞在使用索拉菲尼后SOX9的表达情况。在这一个部分里,我们使用SMMC-7721及LM3的肝癌细胞系进行体外培养,并使用浓度为4μM的索拉菲尼对细胞进行处理,并于0小时,12小时,24小时,36小时,48小时,60小时以及72小时提取细胞RNA及蛋白,并设计Sox9特异性q PCR引物进行定量PCR检测,使用Sox9特异性抗体通过免疫印迹实验进行蛋白含量的检测。此外使用多聚甲醛固定使用4μM索拉菲尼培养0小时,24小时,48小时的细胞,进行免疫荧光及流式细胞仪的检测。结果:1、在使用4μM的索拉菲尼进行培养后,两种肝癌细胞系的Sox9表达无论在转录水平或是蛋白水平均呈上升趋势;2、免疫荧光实验发现在随着使用索拉菲尼培养时间的增加,Sox9在核内的表达上升。3、流式细胞仪检测发现随着培养时间增加,细胞中Sox9阳性的细胞数量显著增加。第二部分研究Sox9表达及干扰对于肝细胞癌对索拉菲尼耐药的影响我们首先构建了Sox9过表达及干扰的肝癌细胞系,使用定量PCR及免疫印迹验证后,使用浓度为4μM的索拉菲尼进行体外培养,于1、3、5、7天使用CCK-8试剂进行细胞活力检测。此外,取培养48小时后的肿瘤细胞进行克隆形成实验观察肿瘤细胞的克隆形成能力,同时使用流式细胞仪进行细胞凋亡状况检测。结果:1、在使用含有索拉菲尼的培养液培养后,过表达Sox9的肝癌细胞活力高于对照组,而干扰Sox9表达的肝癌细胞活力低于对照组。2、过表达Sox9的肝癌细胞在使用4μM索拉菲尼培养48h后,其克隆形成能力高于对照组,其凋亡水平低于对照组,而干扰Sox9的肝癌细胞的克隆形成能力低于对照组,凋亡水平高于对照组。在已构建的过表达及敲减细胞系中使用慢病毒转染入luciferase,验证发光效率后使用Sox9过表达,Sox9干扰以及对照空病毒细胞构建裸鼠的皮下荷瘤及尾静脉注射模型,建模后每72小时按20mg/kg体重给予索拉菲尼灌胃处理。与不同观察节点(0w,1w,3w,5w,7w)记录裸鼠体内荧光信号值,并于7w后取出皮下荷瘤的瘤体,计量体积并称重,分析不同处理组的肿瘤细胞在裸鼠体内的生长情况。结果:1、过表达Sox9组的裸鼠其皮下肿瘤的荧光值高于对照组,7w后其肿瘤重量高于对照组,而干扰Sox9的裸鼠其体内肿瘤荧光值低于对照组,7w后肿瘤重量低于对照组。2、在肺转移模型中,过表达Sox9组的裸鼠肺内肿瘤荧光值高于对照组,而干扰Sox9组的裸鼠体内荧光信号值低于对照组。第三部分Sox9通过Akt通路影响肝细胞癌对索拉菲尼耐药性使用Sox9干扰的7721细胞系,以空病毒7721细胞系为对照进行基因表达谱芯片的检测,检测不同基因的表达情况。并使用Pathway分析观察基因在信号通路的富集清情况。之后使用免疫印迹验证差异基因的表达。结果:1、表达谱芯片显示在Sox9干扰的细胞系中,下调的基因在TGF-β,m TOR,VEGF等通路的存在富集现象,其中与肿瘤耐药密切相关的Akt通路亦存在下调基因的富集,此外作为Akt下游的耐药基因,BCRP亦存在显著下调。根据文献报道,HCC可以通过Oct4-Akt-BCRP产生对化疗药物的耐药性。之后我们使用免疫印迹实验验证了Akt/BCRP通路在Sox9过表达的细胞系中上调,而在Sox9干扰细胞系中下调。2、免疫荧光实验结果显示在使用4μM索拉菲尼处理72小时后的肝癌细胞系中,其Sox9及BCRP的表达均显著上升。第四部分Sox9通过Akt/BCRP影响HCC对于索拉菲尼的耐药性使用相应的慢病毒构建Sox9+/BCRP+/Sox9+BCRP-/NC的细胞系,使用4μM索拉菲尼体外培养后进行Brdu,克隆形成及细胞凋亡实验。使用带有Luciferase的7721细胞感染相应慢病毒从而构建上述四种细胞系,使用这些细胞系构建裸鼠的肿瘤细胞脾注射肝转移模型,之后每72h给予索拉菲尼灌胃,使用活体成像仪记录肿瘤荧光信号。结果显示:1.在使用索拉菲尼后,Sox9+及BCRP+细胞增殖能力、克隆形成能力较对照组高,而凋亡及坏死细胞的比例较对照组低,而Sox9+BCRP-细胞增殖能力及克隆形成能力较对照组减弱,凋亡及坏死的细胞比例较对照组高。2.Sox9+及/BCRP+的细胞系在裸鼠体内的荧光值高于对照组,而Sox9+BCRP-的细胞在裸鼠体内的荧光值低于对照组。结论根据上述结果,结合四部分内容,可以总结得到:1、肝细胞癌细胞系在使用索拉菲尼后,其Sox9的表达在m RNA水平或者蛋白水平均逐渐升高,且HCC细胞系中Sox9阳性的细胞比例增高,由此可以推测Sox9升高有助于肝细胞癌提高对索拉菲尼的耐药性,从而抵抗索拉菲尼对于其的杀伤作用。2、过表达Sox9的肝癌细胞系在索拉菲尼的压力下,较对照组细胞活力高,增殖能力强,细胞凋亡比例低。在皮下荷瘤及尾静脉注射转移的裸鼠模型中,Sox9过表达组的肿瘤在活体成像仪中的信号值更强,而干扰Sox9表达的肝癌细胞系则相反。由此可从另一面验证Sox9升高能够提升肝细胞癌对索拉菲尼的耐药性。3、干扰Sox9的表达谱芯片提示Sox9可影响Akt/BCRP通路的表达,而Akt通路与索拉菲尼耐药密切相关,所以Sox9可能通过调控Akt/BCRP通路影响肝细胞癌对于索拉菲尼的耐药性。之后的拯救实验显示在过表达Sox9的肝癌细胞系中干扰BCRP的表达可以逆转Sox9过表达所带来的索拉菲尼耐药性,由此验证了表达谱芯片中的结论