【摘 要】
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乳酸杆菌作为使用和研究最为广泛的益生菌菌种之一,在不少与人类生活息息相关的重要领域都有应用。罗伊氏乳杆菌是其中研究较为广泛的一种,但目前研究主要集中于罗伊氏乳杆菌对人类的益生效果评价,而罗伊氏乳杆菌对畜禽动物的肠道健康的免疫调节作用和机制却未有足够的研究和关注。本研究旨在阐明罗伊氏乳杆菌（ZJ617）及其组分和培养上清对脂多糖（LPS）致敏体外培养肠道上皮细胞的免疫调节作用,剖析其对仔猪的肠道免疫
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乳酸杆菌作为使用和研究最为广泛的益生菌菌种之一,在不少与人类生活息息相关的重要领域都有应用。罗伊氏乳杆菌是其中研究较为广泛的一种,但目前研究主要集中于罗伊氏乳杆菌对人类的益生效果评价,而罗伊氏乳杆菌对畜禽动物的肠道健康的免疫调节作用和机制却未有足够的研究和关注。本研究旨在阐明罗伊氏乳杆菌（ZJ617）及其组分和培养上清对脂多糖（LPS）致敏体外培养肠道上皮细胞的免疫调节作用,剖析其对仔猪的肠道免疫和屏障功能、肝脏炎症的保护功效及其机理,有益于未来动物肠道健康的益生菌制剂的开发。1)体外细胞试验:ZJ617菌体进行热灭活和超声破碎,上清进行蛋白酶K处理,用于处理猪肠上皮细胞（IPEC-J2）4h,之后用1μg/mL LPS处理细胞4小时构建炎症模型,分析ZJ617预处理对LPS致敏细胞的炎症调控作用,确定发挥调控作用的ZJ617的细胞组分和上清中代谢物。结果显示:与对照组相比,ZJ617可显著抑制LPS诱导的IL-6和IL-12的转录上调、P38和JNK的磷酸化以及I-κBα的降解（P<0.05）。ZJ617上清经蛋白酶K处理与否都具备显著抑制IL-6和IL-12的转录上调、P38和JNK的磷酸化以及I-κBα的降解的能力（P<0.05）,但与未处理的上清相比,经蛋白酶K处理的上清抑制炎症能力显著降低。2)动物试验（肠道）:28日龄仔猪（杜洛克×长白猪×大白猪,雌雄各半,8.6± 1.1kg）分为3组（n=6/组）:CON组和LPS组分别口服PBS 2周后于腹腔注射生理盐水或LPS（25μg/kg）;ZJ617+LPS组口服ZJ617 2周后于腹腔注射LPS。注射LPS后4h处死仔猪,对血清、肠道和肝脏样品进行采集。采用ELISA、免疫印迹Western-blot、免疫组化、代谢组学和16S等方法,解析罗伊氏乳杆菌ZJ617对仔猪肠道的免疫调节作用和保护机制。1)肠道组织结果表明:注射LPS后,肠道通透性增加,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-3的表达水平都显著下调（P<0.05）,p-P38、p-JNK、LC3、ATG5、Beclin-1、Bax 和 SOD2 表达量都显著上升（P<0.05）;ZJ617干预后,肠屏障功能恢复,蛋白表达量恢复至与对照组无显著差异（P>0.05）。2)回肠内容物代谢组学分析表明:与对照组相比,LPS组有4种代谢物显著增加;与LPS组相比,ZJ617+LPS组有5种代谢物显著增加;利用KEGG途径分析发现8条代谢途径发生了显著变化。3)回肠内容物16S结果显示:ZJ617不显著改变菌群的多样性和相对丰度,但ZJ617可以在一定程度上恢复LPS诱导的菌群组成的改变。3)动物试验（肝脏）:研究进一步解析罗伊氏乳杆菌ZJ617对LPS致敏仔猪肝脏炎症的保护效应及机制。结果显示:与对照组相比,ZJ617有抑制LPS诱导的炎性细胞因子NLRP3、IL-6、IL-12和pro-IL-1β的转录上调的趋势;LPS刺激后,肝脏内自噬的相关蛋白LC3、Atg5和Beclin-1表达量显著增加（P<0.05）,诱发过度自噬,而ZJ617能降低LPS刺激诱发的过度自噬;同时肝脏中凋亡相关蛋白Bax和SOD2表达量显著增加（P<0.05）,引发过度凋亡,而ZJ617能降低LPS刺激诱发的过度凋亡。综合分析,罗伊氏乳杆菌ZJ617及其上清均能通过抑制LPS诱导的促炎细胞因子的转录和MAPK炎症信号通路蛋白的表达,显著缓解猪肠上皮细胞的炎症反应及损伤。ZJ617通过介导肠道MAPK信号通路和自噬信号通路,改变肠道内容物代谢物和代谢途径,恢复肠道菌群组成多样性,从而缓解LPS诱导的肠道炎症反应;通过影响炎性细胞因子的转录水平来抑制肝脏炎症信号的传导,抑制由LPS刺激诱发的过度自噬和过度凋亡,以此来缓解LPS诱导的仔猪肝脏损伤。
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