论文部分内容阅读
本研究对我室选育的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）4.0718菌株（国家菌种保藏号：CCTCC NO．200016）携带的P1-P4号质粒用cryⅠ通用引物Unl（d）和Unl（r）进行了PCR分析，并对23kb的P1质粒进行了cryⅠ类基因的PCR-RFLP分析。同时采用生物信息学方法分析了GenBank上公布的cry1Ac基因序列。根据cry1Ac基因启动子上游的同源序列以及终止子下游的同源序列设计了一对引物，通过PCR扩增出一个4.2kb的片段，用PCR-RFLP检测证明包含有cry1Ac基因，并将PCR片段克隆到pUCm—T载体，然后亚克隆到E．coli-B．thuringiensis穿梭载体pHT304上，并在E．coli DH5α中表达出了130kD的原毒素，另外还电转化了无晶体突变株。 实验结果如下： 1．质粒的PCR鉴定 对苏云金芽孢杆菌4.0718菌株携带的P1—P4号质粒分别回收，用cryⅠ基因通用引物Unl（d）和Unl（r）对三种质粒进行了PCR扩增，P1—P3号质粒都产生了277bp的目的片段，说明这三个质粒上都带有cryⅠ类基因。采用cry基因PCR-RFLP鉴定方法，合成了相应的PCR引物，以23kb质粒为模板，将扩增出的1.6kb产物回收后用PstⅠ+XbaⅠ双酶切，产生了1117bp、801bp、518bp、322bp四种片段，对照模式基因的PCR-RFLP鉴定图谱，证明了23kb的质粒上携带有cry1Aa基因和cry1Ac基因。 2．cry1Ac基因的克隆 由于Cry1Ac蛋白对鳞翅目（Lepidoptera）昆虫的的高毒杀能力，在构建抗虫工程菌以及抗虫植物方面已经受到了广泛的重视，至今在GenBank上已经登记了14种cry1Ac基因，本研究阵列比较了14种cry1Ac基因的核营酸序列，发现这些序列具有很高的同源性，并且在‘厂刀Ac的启动子上游以及终止子下游同样也具有很高的同源性，根据这些数据设计了一对引物PR一OF一1和PR一OF一2，用以扩增包含“y1Ac上游启动子、‘厂刀月c结构基因以及一下游终止子的片段，PCR结果与预测结果一致，产生了4.Zkb的目的片段，PCR一RFLP分析证明包含了‘了二刀月c基因。 PCR扩增的4.Zkb片段在其3’端带有一个A，用T载体pUCm一T与其连接后转化大肠杆菌，.获得了正向连接的pTCg和反向连接的pTCI1重组子，质粒酶切以及PCR一RFLP证明了克隆的正确性。用BamH工和SaH将pTCg、pTCn质粒酶切后电泳，试剂盒回收4.Zkb的片段，用一BamH工和Sall同样处理E.。。1z’一thurz’n盯ensz’s穿梭载体pHT304，将两个片段连接后转化E.co1z’DH5Q，得到了重组子pHC34.3.重组子pHc34在大肠杆菌中的表达- 根据改进的表达产物纯化方法培养EHC34菌株提取表达的Cry IAC蛋白，与空白E. eolj DH5a（pHT3O4）表达蛋白的SDS一PAGE图谱对照，发现EHC34菌株产生了1 30kD的原毒素，说明克隆片段在宿主菌中得到了表达.